植物基因克隆的方法

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1、植物基因的克隆基因2.基因克隆3.基因克隆的目标基因：为RNA或蛋白质编码的核苷酸序列。基因克隆：利用体外重组技术，将特定基因和其它DNA顺序插入到载体中。克隆目标：识别、分离特异基因并获得基因的完整全序列，确定染色体位，阐明基因的生化功能，明确其对特定性状的遗传控制关系。植物基因克隆的方法序列克隆2.依据序列同源性克隆基因3.人工合成并克隆基因4.表型克隆5.功能克隆6.定位克隆7.转座子标记法方法一：根据已知基因的序列设计并合成一对引物，从植物中提取DNA进行PCR扩增，扩增的片段经纯化后连接到合适的载体上，用酶切和序列分析检测重子，并与已知基因序列进行比较。序列克

2、隆1.1根据已知基因的序列方法二：在其它种属的同源基因被克隆的前提下，构建cDNA文库或基因组文库，然后以已知的基因序列作为探针来筛选目的克隆。例子：根据甜菜碱醛脱氢酶基因序列克隆菠菜碱醛脱氢酶基因、自交不亲和基因、花形态建成基因。1.2根据DNA测序结果方法一:利用Adams等建立的表达序列标记(EST)寻找新基因.从组织或细胞特异性的cDNA文库中随机挑选克隆→5’端或3’端部分序列(EST,约400bp)测定→GeneBank/EMBL检索→检测所测序列或氨基酸序列与已知序列是否同源→发现新基因方法二:利用Velculescu等建立的基因表达连续分析法(SAGE)

3、.◆此种方法只需检测基因表达库中每一cDNA的很短序列(9bp),建立基因表达图,根据基因表达图就可以发现新基因.◆cDNA测序法只能分离特定时空下表达的基因,且不能分析基因内和基因间的调控序列,克隆出的新基因的功能也有待鉴定.方法：根据已知的氨基酸或核苷酸序列，采用植物偏爱的密码子，人工合成并克隆该基因。（可对基因进行改造）例子：根据蜘蛛毒素的氨基酸序列，人工合成并克隆了此肽的基因。人工合成Bt基因。人工合成并克隆基因方法：利用植物的表型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆植物基因。此方法试图把表型与基因结构或基因表达联系起来，从而分离特定表型相关基因。不必事先知道

4、基因的生化功能或图谱定位，根据基因的表达效应就直接分离该基因。例子：利用表型差异从拟南芥中克隆出赤霉素合成酶基因。表型克隆（phonetypicalcloning）技术支持：差别筛选法（differentialscreening）扣除杂交技术（subtractivehybridization）mRNA差异显示技术（mRNAdifferentialdisplayreversetranscription-PCR）代表性差异显示（representationaldifferenceanalysis）抑制性扣除杂交（suppressionsubtractivehybridiza

5、tion）局限性：表型克隆技术普遍存在着依赖于PCR技术、重复性较差、加阳性率高、对实验材料要求较高、材料间不能存在过多的差异，结果不便确证等缺点。定义：根据性状的基本生化特性这一功能信息，在鉴定和已知基因的功能后克隆.方法：纯化相应的编码蛋白→构建cDNA文库或基因组文库→筛选基因。特点：用基因表达的产物蛋白质来克隆基因.功能克隆（functionalcloning）1、将纯化的蛋白质进行氨基酸测序，推测可能的mRNA序列,据此合成寡核苷酸探针从文库中筛选编码基因。2、将相应的编码蛋白制成相应的抗体探针，从文库中筛选相应基因并克隆。3、根据mRNA序列设计相应的寡核苷

6、酸引物,对核DNA或cDNA进行PCR扩增.1.1根据基因表达的蛋白质通过阳性克隆或PCR扩增产物的序列分析鉴定分离基因.关键:首先应根据已知的生化缺陷或特征确认与该功能有关的蛋白质进行分离纯化.要求分离一个纯度很高的蛋白质.局限性:大多数基因产物至今还不清楚,即使知道了也不能纯化足够的蛋白质供氨基酸测序或制备抗体.1.2根据基因的表型突变互补功能植物的许多基因与细菌或酵母的突变体互补.如拟南芥的cDNA文库可与酵母的8个营养缺陷突变体互补.根据这一特性可分离一些基因,如来自蛋白激酶基因和葡萄糖载体基因等.利用此法分离基因需做大量的转化工作,且转化细胞中突变体频率较低.

7、例子1、分离纯化了黄瓜花叶病毒、马铃薯x病毒等，并克隆了编码这些病毒外壳蛋白的cDNA基因。2、构建天麻cDNA文库，制备抗体探针成功地分离了编码天麻抗真菌蛋白基因cDNA克隆。定义：根据遗传连锁分析，染色体步移将基因定位到染色体的一个具体位置上后不断缩小筛选区域进而克隆该基因。连锁分析：通过基因与DNA标记之间的重组系数估计两者之间的距离，若某种性状的基因与DNA标记在子代不分离，即有连锁在一起的趋势。因此可将与某一DNA标记连锁的基因在染色体上定位。定位克隆(positionalcloning)原理用该法分离基因是根据功能基因在基因组