植物基因克隆方法ppt课件.ppt

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1、植物基因克隆方法植物基因的分离方法隋娜山东师范大学生命科学学院一、基因克隆（分子克隆molecularcloning）通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。二、基因克隆的核心---体外重组(Recombination)人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。载体DNA（vector）目的DNA（targetfragment）重组DNA（recombinantDNA）宿主（host）筛选、扩增克隆（clone）基因克隆的路线DNA重组转化用何种方法取决于基因产物（

2、Geneproducts）的丰度以及gene的相关背景知识，如geneoritsprotein的表达模式及初级结构等（一）已知基因产物的基因分离（二）未知基因产物的基因分离（一）已知Geneproducts的基因分离1、利用DNA探针筛选基因文库前提是已知一段DNA序列并构建了基因文库●同源(homologous)DNA探针为了克隆一个完整基因结构或研究调节序列。●异源(Heterologous)DNA探针利用一种植物的一段DNA序列作探针，从其它植物中克隆同源基因注意：有的基因在不同物种间同源性很高，有的则很低。2、利用pr

3、otein信息分离基因前提是所研究的protein可以从植物中分离纯化●利用antibody筛选表达文库(ExpressionLibrary)AntibodyproductionConstructionofExpressionLibrary●利用protein测序的氨基酸信息Probe(oligonucleotides)Primer(degeneratedprimer)(b)Oligonucleotideprobesorgeneratedprimersforgeneswhosetranslationproductshavebe

4、encharacterizedp176Trp-Asp-Glu-Asn-Asn-Met122221(16species)Ser-Glu-Try-Leu-Thr-Asn622642(1152species)RT-PCRandRACEPCRReverseTranscription,RapidAmplificationofcDNAEnds问题1：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。原因：1）RNA被降解建议解决方法：利用无污染技术分离RNA； 如果使用RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0。2）RNA中包含

5、逆转录抑制剂建议解决方法：通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗。    逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，甲酰胺和胍盐。RT-PCR实验中的常见问题与对策3）多糖同RNA共沉淀建议解决方法：使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。4）起始RNA量不够建议解决方法：增加RNA量。 对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。5）RNA模板二级结构太多建议解决方法：将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火.提高逆转录反应温度，对S

6、uperScriptⅡ可以到50℃，对ThermoScript可以到65℃。    注意：不要在＞60℃时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP。对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反应温度≤65℃。 注意：不要在高于37℃时使用M-MLV。如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。6）PCR引物设计较差建议解决方法：避免在引物3‘端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。7）镁离子浓度太低建议解决方法：从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个

7、模板和引物对的最佳镁离子浓度。8）退火温度太高建议解决方法：把退火温度设定为低于Tm5℃。因为公式估算Tm值比所有真正的退火温度实际会高些或低些。9）富含GC的模板建议解决方法：对于GC含量＞50％的模板，使用PCRxEnhancerSolution。问题2：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。原因：1）引物和模板非特异性退火建议解决方法：以2℃到5℃间隔增加退火温度，减少退火时间。    在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度。 使用PlatinumTaqDNA进行自动热启动PCR。2）引物设计较差避免在

8、引物3‘端含有2到3个dG或dC。3）RNA中沾染了基因组DNA4）镁离子浓度太高建议解决方法：优化镁离子浓度。5）因为扩增复杂模板导致引物错误起始建议解决方法：使用巢式PCR或递减PCR。RACEPCRPCR和细胞内DNA复制的相同点：（1）两者都符合半保留复制模型，即两