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1、植物基因克隆的策略与方法基因的克隆就是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传控制关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速发展,使人们掌握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,1997
2、),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。1 功能克隆(functionalCloning) 功能克隆就是根据性状的基本生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的筛选根据情况主要可用二种办法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中筛选相应克隆。功能克隆是一种经典的基因
3、克隆策略,很多基因的分离利用这种策略。locatedintheTomb,DongShenJiabang,deferthenextdayfocusedontheassassination.Linping,Zhejiang,1ofwhichliquorwinemasters(WuzhensaidinformationisCarpenter),whogotAfewbayonets,duetomissedfatal,whennightcame Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,
4、可以提高对灰质葡萄孢(Botrytiscinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因经过转基因后,对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性很有意义(Hain等,1985)。Kondo等1989年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DNA做了克隆和序列分析(Kondo等,1989)。周兆斓等构建了水稻cDNA文库,分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的cDNA(周兆斓等,1996)。植物蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质,它可抑制摄食害虫对蛋白质的消化,使害虫因缺乏所需氨基酸而导致非正常发育或死亡。胡天华等人从烟草中分离出流行于我国的黄瓜花叶病
5、毒(CucumberMosaicvirus)(CMV),并克隆了编码该病毒外壳蛋白的cDNA基因(胡天华等,1989)。王春香等从感病的烟草叶片中分离纯化了马铃薯x病毒(potatovirusX,pvx),克隆了完整的马铃薯x病毒外壳蛋白基因,并将外壳蛋白基因转入马铃薯中,以期获得抗pvx病毒的栽培种马铃薯(王春香等,1991)。病毒外壳蛋白(Coatproteincp)基因的成功克隆,可使转基因植物中产生病毒外壳蛋白基因介导的抗性(CoatProteinMediatedResistanceCPMR)或病毒CP-RNA介导的抗性。Vankan报道从真菌中成
6、功的克隆出无毒基因Avr9,可直接利用此基因介导广谱高效的基因工程植物(VanlocatedintheTomb,DongShenJiabang,deferthenextdayfocusedontheassassination.Linping,Zhejiang,1ofwhichliquorwinemasters(WuzhensaidinformationisCarpenter),whogotAfewbayonets,duetomissedfatal,whennightcameKan等,1991)。我们1995年构建了天麻cDNA文库,制备抗体探针成功地分离了
7、编码天麻抗真菌蛋白基因的cDNA克隆,为抗真菌基因在农业、医药等方面的应用打下了基础(舒群芳等,1995;舒群芳等,1997)。功能克隆的特点是用基因表达的产物蛋白质来克隆基因、虽然某一性状的编码基因是未知的。如果对其生理生化及代谢途径研究的比较清楚,就可以分离和纯化控制该性状的蛋白质。因此功能克隆的关键是分离出一个纯度很高的蛋白质。只要有一个纯的蛋白质,得到十分特异的探针,这一策略是行之有效的。采用功能克隆方法虽然已经克隆了很多基因,但由于绝大多数基因的产物目前还不知道。所以大多数基因难以用这一经典的方法来克隆。随着分子生物学技术的发展,一条新的基因克隆
8、策略逐渐形成,这就是定位克隆。2 定位克隆(Positionalc
