疾病基因克隆的策略及主要方法

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1、疾病基因克隆的策略及主要方法申海鹰周元国（第三军医大学野战外科研究所分子生物学中心，重庆400042）摘要疾病基因的分离和克隆是功能基因组学的研究热点，具体策略的选择取决于疾病背景资料的掌握程度，为能快速、准确地克隆出目的基因，本文介绍两类常用的基因克隆策略——定位克隆策略、功能克隆策略——及其主要方法，如：家系连锁分析、等位基因共占法、人群相关分析法、抑制性消减杂交、差示反转录PCR、差异消减显示法、代表性差异分析法、比较基因组杂交等，并作简要的评价。关键词基因；定位克隆；消减杂交学科分类号Q785Strategiesandmethodsforcloning

2、pathogenicgeneSHENHai-ying,ZHOUYuan-guo.(CenterofMolecularBiology,ResearchInstituteofSurgeryandDapingHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042)AbstractIsolationandcloningofpathogenicgeneisahotspotinfunctionalgenomestudy,whileitisthediseasebackgroundwhichdecidestheselec

3、tionofthestrategies.Twostrategies,mappingstrategyandfunctionalcloningstrategy,whichcanclonetheobjectivegenerapidlyandaccuratelywereintroduced.Somemainmethodsincludingfamily-basedlinkageanalysis,allelesharingmethod,populationassociationanalysis,suppressionsubtractivehybridization(SSH

4、),differentialdisplayreverse-transcriptionPCR(DD-RT-PCR),differentialsubtractiondisplay(DSD),representationaldifferenceanalysis(RDA),comparativegenomehybridization(CEH)wereelucidatedbriefly.Keywords:Gene;Mappingclone;Subtractivehybridization基因组全序列测定可望提前完成，而以功能鉴定为中心的功能基因组学应运而生，将人类5~1

5、0万个基因定位及克隆是一项庞大而艰巨的任务。自1911年Wilson将色盲基因定位于X染色体起，随着连锁分析方法的发展和体细胞杂交、重组DNA、分子杂交以及PCR技术的发现和应用，陆续出现了几种改进或全新的遗传学基因定位和克隆方法。与此同时，另一类以消减杂交为基本原理的代表性差异分析、基因组错配扫描、比较基因组杂交及mRNA差示等方法的出现和应用，使一些多基因遗传病相关致病基因的筛查和定位面临突破。迄今为止，约有5000个遗传性状被定位，其中400多个为致病基因［1］。根据不同的背景资料，人类基因克隆可采取的思路有以下四种（见附图）：目前人类基因克隆的主要策略

6、有三种：一是反向遗传学定位克隆策略，它通过RFLP、微卫星DNA等遗传标记，先获得某一表型基因在染色体上的定位，再在候选区域内选择已知基因，进行致病突变的筛选，并获得cDNA及全基因；另一类是从蛋白质功能着手的功能克隆策略，采用以消减杂交为策略的多种分子生物学手段，先通过消减获得特异表达或缺失的基因片段，然后进行染色体定位乃至获得全基因。本文拟就前两种主要策略和各自方法的优缺点作一介绍和分析。此外，尚有介于两者之间的候选克隆策略，包括定位候选克隆和功能候选克隆，前者是在将疾病基因以连锁分析和染色体分析基本定位以后，再在候选区域内选择所有已知基因进行致病突变的筛

7、选。后者是根据致病基因的可能功能，检测Genbank中的基因功能区域，将含有接近功能域的基因用于致病的突变检测。1.定位克隆（positionalcloning）策略其基本思路是通过连锁分析（linkageanalysis）原理进行基因定位。若多态标记与待定基因距离较远，则它们在向子代传递时会发生自由分离，呈“连锁平衡”；反之，则不发生自由分离，而呈现“共分离（cosegregation）”现象，即“连锁不平衡”。据此可在染色体上定位与某一DNA标记相连锁的基因。两基因间连锁程度以遗传距离表示：1厘摩(cM)=1%重组率，即1000kb。DNA标记的选择经历了

8、从致病基因→ABO、HLA多态位点→R