ta克隆原理及方法

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1、一站式科研技术服务商—武汉金开瑞生物www.genecreate.comTA克隆原理及方法一、PCR产物的T载体克隆（一）重组T质粒的构建一．原理外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体

2、DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：首先，T4DNA连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。因为DNA片断有两个端

3、点，所以切割时出现两种可能，一种是单酶切，另一种是双酶切，这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。对于单酶切来说，载体与供体的末端都相同，连接可以在任何末端之间进行，这样就导致了大量的自连接产物。为了减少自环的高本底，可对载体进行5’除磷酸处理，原理是连接酶只能连接DNA片断的3’OH末端与5’端，所以除磷后载体不会自环。一旦有外源片断插入时，由外源片断提供5’端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的自环造成的高本底。对于双酶切来说，无论载体与供体同一片段上都有不同的末端，这样就避免了载体

4、与供体的自环，能使有效连接产物大大增加。双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。TaqDNA酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与pGEM-TEasyVector末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。二．材料与方法1材料外源DNA片断2仪器、用具移液枪

5、、碎冰3试剂pMD18-TVector；Ligationbuffer；T4ligatease；rATP4方法连接体系如下：7一站式科研技术服务商—武汉金开瑞生物www.genecreate.com16℃连接过夜。（二）重组质粒的转化及阳性克隆的鉴定1材料E.coliJM109菌株2仪器、用具超净工作台、离心机、恒温摇床、恒温培养箱、培养皿、试管、1.5ml离心管、电泳仪、电泳槽、凝胶样品梳、移液器3试剂(1)CaCl2、LB平板（见附录）；SOC培养基（见附录）；SOB培养基(2)RNaseA1；Buf

6、ferS1；BufferS2；BufferS3；BufferW1；无水乙醇的BufferW2a(3)1×电泳缓冲液（TAE）；溴化乙锭溶液（EB）[有毒，小心]；琼脂糖；6×加样缓冲液(4)酚；氯仿；异戊醇(5)ddH2O；10×PCRBuffer(Mg2+plus)；dNTP；M13+；M13-；TaKaRarTaq酶4方法1.大肠杆菌感受态细胞的制备(1)取大肠杆菌JM109保存液50μl，接种于4mlLB（或SOB）液体培养基中，37℃，300rpm振荡培养过夜，第二天取50μl转接到新的4mlL

7、B（或SOB）液体培养基中扩大培养3h至OD600=0.35～0.4，在无菌操作台上取1ml菌液于1.5ml离心管中，冰浴10min。(2)4℃，5000rpm离心2min，去上清液。(3)加入750μl预冷的0.1MCaCl2重悬菌体，冰浴30min。(4)4℃，5000rpm离心2min，弃上清液。(5)加入100μl冰冷的0.1MCaCl2轻轻重悬菌体，冰浴2h后，4℃保存备用。2.重组DNA的转化(1)将含Amp、X-Gal、IPTG的LB平板37℃预热。(2)于100μl感受态细胞中加入10μ

8、l连接产物，冰浴30min。(3)将离心管转入42℃水浴，热冲击90秒，然后不要摇动离心管，迅速将其放在冰上2min。(4)在离心管中加入SOC培养基300μl，枪头混匀，37℃、150rpm温和摇振60min。(5)将200μl转化菌液均匀地涂布于含50mg/mlAmp、20mg/mlX-gal、200mg/mlIPTG的LB平板上，37℃倒置培养过夜，挑选白色菌落进行鉴定。注意事项：①制备感受态细胞的全部操作均须于冰浴操作，同时注意近火