植物基因克隆研究方法综述

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1、硕士研究生课程论文课程名称提交时间学号姓名所在学院任课教师植物基因克隆研究方法综述摘要：基因克隆技术诞生至今，获得快速发展，各种克隆方法应运而牛・。为了纵览植物基因克隆的发展创新历程，本文对各种技术体系，如鸟枪法、文库法、PCR扩增法、化学合成法以及图位克隆法进行了综述。随着后基因纟R时代的到来，植物基因克隆技术将发挥更加重要的作用。关键词：基因克隆；鸟枪法；文库法；PCR扩增法：化学合成法；图位克降法基因是细胞内DNA分子上具有遗传效应的特定核昔酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。基因控制蛋白质合成，是不同物种以及同一物种的不

2、同个体表现出不同的性状的根木原因。基因通过DNA复制及细胞分裂把遗传信息传递给下一代，并通过控制蛋口质的合成使遗传信息得到表达。釆用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特杲切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA分了。在此基础上，这个杂合分了能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程叫基因克隆。基因克隆技术包括了一系列技术，它人约建立于2（）卅纪7（）年代初期。美国斯坦福人学的伯格（P・Berg）等人于1972年把一种猿猴病毒的DNA与X噬菌体DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这2种DNA分子

3、连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子［1］,从此产生了基因克降技术。1973年，科恩（S.Cohen）等人把一段外源DNA片段与质粒DNA连接起來，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒转入人肠杆菌，第一次完整地建立起了基因克隆体系［2］。因此，克隆程序可概括为：分、切、连、转、选。“分”是指分离制备合格待操作的DNA,包括作为运载体的DNA和欲克隆的H的DNA片段；“切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA,或者用物理方法切割载体DNA,从而得到目的基因；“连”是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起來，形成重组的DNA

4、分子；“转”是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入猶主细胞中进行复制和扩增；“选”则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分了的个体。一般来说，基因克隆技术包括•把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA,然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。因此，基因克隆技术又称为分子克隆、基因的无性繁殖、基因操作、重组DNA技术以及基因工程等。它最基本的特点是分子水平上的操作和细胞水平上的表达。目前,在玉米,水稻、汕菜、拟南芥、烟草、番茄等多种植物中,已经克隆了许许多多与植物的产量

5、、品质、抗性及农艺性状等相关的基因。木文对基因克隆的方法进行综述，以把握植物基因克隆技术的发展历程，并对未來的发展趋势进行展望。1鸟枪法“鸟枪法”是一种由生物呈因纽捉取冃的基因的方法。首先利用物理方法（如剪切力、超声波等）或酶化学方法（如限制性内切核酸酶）将牛物细胞染色体DNA切割成为基因水平的许多片段，继而将这些片段与适当的载体结合，将重组DNA转入受体菌扩增，获得无性繁殖的基因文库，再结合筛选方法，从众多的转化了菌株中选出含冇某一基因的菌株，从中将重组的DNA分离、M收。这种方法可以说是利用“溜散弹射击”原理去“命屮”某个基因。由于目

6、的基因在整个基因组中太少太小，在相当程度上还得靠“碰运气”，所以人们称这个方法为“鸟枪法”或“散弹枪”实验法［3］。鸟枪法也有很大的局限性，真核生物基因人都由有编码功能的序列——外显了和无编码功能的序列——内含了，两者比例为1:4构成。因为冇内含了的存在，这样获得的结构基因不宜在原核宿主组织中表达。所以，要获得真核生物的目的基因，准确的说要获得真核生物目的基因的编码序列，不宜用“鸟枪法”。2文库法2.1基因组文库法基因组文库法是一-种直接从基因组中分离目的基因的方法。所谓基因组文库(genelibrary或genebank),是指汇集某一

7、基因组所冇DNA序列的重纽.DNA群体。高等真核生物染色体基因纽文库通常是以X噬菌体作为载体构建的，有时也可以柯斯质粒作为载体构建。利用入噬菌体载体构建基因组文库的一般操作程序如下：(1)选用识别序列均为4个核廿酸的2种限制性内切核酸酶，对从某一高等真核生物组织细胞中提取的染色体基因组DNA进行部分酶解，得到10〜30kb的DNA限制性片段，利用凝胶电泳法等从中分离出大小为20kb左右的随机片段群体。(2)选用适当的限制性内切核酸酶酶解入噬菌体载体DNAo(3)经适当处理，将基因组DNA限制性片段与入噬菌体载体进行体外重组。(4)利用体外

8、包装系统将重组体包装成完整的颗粒。(5)以重组噬菌体颗粒侵染大肠杆菌，形成大量噬菌斑，从而形成含有整个DNA的重MDNA群体，即文库。具备了文库，就可以用适当的目的基因片段作探针，利用高密度的