植物基因克隆的载体

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1、第三章基因克隆载体Vectors载体(vector)：在基因工程中，携带目的基因或DNA片段进入宿主细胞进行扩增或表达的DNA分子。一、载体的概念作为载体使用的必须是能进入植物寄主细胞内进行复制和表达的核酸分子。二、载体的功能1、运送外源基因高效转入受体细胞；2、为外源基因提供复制能力或整合能力；3、为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。三、发展概况1.第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322(1977,Bolivaretal)2.第二阶段：增大载体容量（降低长度），建立多克隆位点区和新的遗传

2、标记基因。如pUC系列载体。3.第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。按载体性质分四、分类质粒载体、噬菌体载体和人工染色体目前发展起来的植物基因转移的载体系统分为两大类：一是病毒载体系统二是质粒载体系统※（1）有复制起点※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点※（3）具备合适的筛选标记※（4）具备合适的拷贝数目（5）分子量要相对较小（6）在细胞内稳定性要高（7）易分离纯化※表示载体必须具备的条件五、基因工程载体必须具备的条件第一节质粒载体一、质粒(plasmi

3、d)独立于细菌染色体外的能独立复制的双链闭合环状DNA分子细菌中发现，偶见于链霉菌和酵母比病毒还简单的亚细胞结构，一旦离开寄主细胞则无法繁殖。大肠杆菌的质粒二、质粒的发现和命名1946年，第一个被发现的细菌质粒是大肠杆菌的F因子，它的发现对细菌遗传学的发展产生了深远的影响。1957年，日本学者报道了志贺菌(Shigella)中质粒介导抗生素抗性的转移现象。（一）质粒的发现在以后的20多年中，陆续发现各种细菌携带质粒，且它们的表型特征已远远超过了致育性和药物抗性的范围。70年代末，随着遗传工程的崛起，质粒作为载体己被广泛应用在遗传工程和分子生物学的研究中。对很多不同微

4、生物中的质粒进行了基因克隆和生物学功能分析，使质粒的生物学跨入了空前繁荣的研究时期。二、质粒的发现和命名（一）质粒的发现（二）质粒的命名原则质粒可以依据其表型效应、大小、复制特性、转移性或亲和性差异划分为不同的类型。最初发现的质粒均由研究者根据表型、大小等特征自行命名，如F因子(fertilityfactor，致育因子)、R质粒(resistancefactor，抗性质粒)和Col质粒(colicin，大肠杆菌毒素质粒)等。随着研究工作的深入和发展，愈来愈多的含有质粒的微生物新类群和新质粒被发现，但由于缺乏统一的命名规则而导致文献中质粒名称的混乱。其规则是：质粒的名

5、称一般由三个英文字母及编号组成，第一个字母一律用小写p表示，后两个字母应大写，可以采用发现者人名、实验室名称、表型性状或其他特征的英文缩写。编号为阿拉伯数字，用于区分属于同一类型的不同质粒，如pBR322、pUC18和pUC19等。直至1976年Novick等才提出一个可为质粒研究者普遍接受和遵循的命名原则。（二）质粒的命名原则命名举例pBR322是最早构建的质粒之一“p”表明它是一个质粒“BR”表示最初构建它的两个人的名字首字母：Bolivar和Rodriguez“322”区别于该实验室构建的其他质粒，如pBR325、pBR327等三、质粒的基本特性（1）质粒分子

6、较小一般为1-200Kb，最大的可达1400kb(如苜蓿根瘤菌质粒pRm141a)。（2）编码特性——表型多样化如抗生素的抗性、产生抗生素、降解复杂有机化合物、产生毒素（如大肠杆菌素、肠毒素）、合成限制性内切酶或修饰酶、生物固氮和杀虫等。3、质粒的存在形式体外理化因子作用下可形成下列形式开环DNA分子(oc-DNA)线性DNA分子(l-DNA)超螺旋DNA分子(scDNA)生理条件下：以共价闭合环状DNA分子(Covalentclosecircular,ccc-DNA)形式存在三、质粒的基本特性在变性条件下，质粒可成为单链DNA分子（ss-DNA）。同一质粒尽管分子

7、量相同，不同的构型电泳迁移率不同：scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。（4）质粒空间构型与电泳速率三、质粒的基本特性（5）自主复制性携带有自己的复制起始区（ori）控制质粒拷贝数的基因能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制（6）不相容性同一复制系统的不同质粒在同一细菌中不能相容，不同复制系统的质粒在同一细菌中可共存（7）可扩增性质粒就其复制方式而言分为两类松弛型复制严谨型复制（8）可转移性在天然条件下，大多质粒可通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内。非结合细菌可通过人工方法进行转化（1）质粒对宿主的生存不是必需的，只是“友好”的“借居