植物基因克隆实验总结

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1、2015-2016第二学期生物科学实验（植物基因克隆）实验总结班级：13级生物科学2班学号：1312022005姓名：邓伟强U期：2016年6刀10U一、实验原理及方法：实验原理：基因的克隆就是利用体外重组技术，将特定的基因和芄它DNA顺序插入到载体分子屮。基因克隆的主耍目标是识别、分离特异基因丼获得基因的完整的全序列，确定染色体定位，阐明基因的生化功能，明确其对特定性状的遗传控制关系。通过几十年的努力由于植物发育，生理生化，分+遗传等学科的迅速发展，使人们掌握了大量宥关植物优R性状基因的生物学和遗传学知识，再

2、运用先进的酶学和生物学技术已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆，育性、高蛋白质及与楨物发育有关的许多基因。实验方法及过程：1.CTAB法提取水稻基因组DNA配制CTAB溶液：(2gCTAB，3.17gNacl，lmol/LTrisHcl10ml(PH8.0)，EDTA4ml，最后定容至100ml.)配制TBE溶液:(24gTrisHcl，1.488gNa2EDTA.2H2O，llg硼酸，最后定容至200ml.)2.配置琼脂糖缓冲液:lOxTBEBuffer配制方法：每组需要：称量下列试剂，置于1L烧杯中

3、Tris：108gNa2EDTA-2H2O：7.44g硼酸：55g向烧杯中加入约800ml的无菌水，充分搅拌溶解。加无菌水将溶液定容至1L后，室温保存。用时稀释。2.开发设计引物LOC_Os02g42310Chromosome2:25,442,875-25,450,093OsSCPS-PutativeSerineCarboxypeptidasehomologue，expressedOryzasalivaJaponicaCX：ATATGTCAACATCTCArCrCCCiTarncrCTrrAGAAAAAAATC

4、AGAACGzGAGTAACAAAACACAACTAGAGfiACACATACATAT

5、AGACG.VGAGriOryzaxafivabidicaGCGCCGGAGACGAAGAATTGzAGGGrrC.GA?AGTAACTAGCT?GnTGxn，CvTCTTTzGGAGA//GTrTG

6、05.003.00ACTCTGGACCGTGCAAACTTLength：201japonica,193Indica3.PCR反应体系10x扩增缓冲液：每管：2ul共需：24uldNTP混合物：每管：0.8ul共需：9.6ul模板DNA:每管3ul,共需36ulTaqDNA聚合酶:每管0.3ul，共需3.6ul引物1、2:每管：2d（骱引物lul、肜引物lul）共需24ul。两种引物各6管。引物1、2代表的体系分别加火菌水71.4u侄120ul,分装6个ep管。4.PCR反应程序95°C预加热5分钟，95°C30

7、秒钟、56°C30秒钟>35循环72°C30秒钟72°C10分钟16°C5分钟总吋长：1小吋35分钟2.琼脂糖凝胶电泳制胶：称取1.6g琼脂糖于配好的160mlCTAB溶液(稀释10倍后的)中，在微波炉中加热溶解，冷却后，加入3ul的核酸染色剂(BE)。倒胶：插入梳子，摇匀之后倒胶(1LTBE缓冲液，淹没琼脂)，避光静置大概20min。点胶：■直拔掉梳子，把凝好的胶取出來放在有与制胶同浓度TBE缓冲液的电泳槽中。在第一个胶孔中加入maker,作对比。上样：取2ulLOadingBfftier(—种沉淀剂，使点胶

8、后样品沉到胶孔底部不浮上来)混匀10ul的DNA样品。用移液枪打入胶孔。电泳：电压电流(100V、100mA)跑40min。3.紫外灯下观察条带条带清晰一段说明含DNA多。4.切胶回收(1)切胶，然后加入胶的三倍体职的BufferGA(若小丁*300bp，按1:5)木组切下的三份胶均为0.15g,分别加入丫450ul的BufferGA(2)55度水浴10分钟，期间摇晃2〜3次(3)加入