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1、世界农业WorldAgriculture200012(总250)基因是染色体上具有一因。定座位的遗传单位,是21通过遗传表型分析DNA分子中一定长度的核植(1)基因标鉴法。该法苷酸序列。植物的生长发育是利用转座子或T-DNA是在多种代谢和生理过程基物插入植物的基因组中引起某础上所发生的基因在时空上一基因失活产生一些突变表达的综合现象,开发和分基体,然后用相应转座子或离潜在的各种有价值的基因浙T-DNA对突变体文库进江并深入研究其表达机理,对因行筛选,以选到的阳性克隆大作物品种的改良具有重要意学片段为探针,再筛选野生
2、型农义。因此对植物基因的克隆克植物的基因文库分离目的基业并发展与之相关的技术已引和因。如将一株带有功能的转起人们的日益关注和投入,隆生位因子系统的植物与另一株物近年来其研究方法不断改技在遗传上有差异的同种植物进,新技术不断涌现,这为技术杂交,在杂交后代中筛选由学进一步研究诸如各种调节植院于转位因子插入到某一特定物生长发育的基因、逆境与术基因序列中导致表型破坏或俞防御反应的基因、植物细胞改变的突变株,用该纯合突志凋亡的基因等提供了新的途及华变株构建基因文库,然后将径。转位因子用同位素标记作探其针,从该文库中筛选出带有
3、一、常用的目的同源转位因子的目的基因。基因克隆技术发该法主要限于二倍体的自花11通过已知基因产物授粉作物如玉米、金鱼草的分析和鉴定展等。应用该法已分离出与玉这类技术主要通过生物米种子发育有关的Vivipar2化学和病理学研究分离鉴定ious-l基因及与金鱼草花有关基因的蛋白产物,并对蛋白质氨基酸顺序发育有关的一些基因等。进行分析,推断出编码该蛋白质的基因序列,(2)激发子的寄主受体基因克隆技术。该然后通过抗体、寡聚核苷酸探针或PCR制备技术是利用病菌无毒基因(avrgene)编码的激的探针对文库进行筛选来分离目的基
4、因。如植发子与寄主抗病基因编码的受体之间存在不亲物抗病虫基因工程中常用的苏云金杆菌杀虫晶和的互作关系,以病原激发子蛋白为线索分离体蛋白基因(Bt基因)、豇豆胰蛋白酶抑制基和克隆寄主中的受体蛋白基因。应用该技术已因(CpTI基因)、病毒外壳蛋白基因(CP基分离和克隆出一些几丁质抗病基因,如番茄与因)等。当其他植物的同类基因已分离到并且无毒基因avr9对应的抗病基因cf9,与avrP2核苷酸序列保守性较高时,也可直接用这些已to对应的抗病基因pto;拟南芥菜与avrRPS2知的基因片段作探针对未克隆到该基因的植物对应的
5、抗病基因rpS2等。基因文库进行筛选,也可分离到未知的新基31以图谱为基础的定位克隆技术-37-200012(总250)世界农业WorldAgriculture以图谱为基础的定位克隆技术在分离未知探针与亲本DNA或核DNA文库杂交,确定产物的基因方面有广阔的应用前景。该法的基出这些DNA片段所编码的基因。应用上述方本前提是基因定位,然后以紧密连锁的分子标法已分离出拟南芥菜与赤霉素合成有关的基因记如RFLP等为起点,通过染色体步移逐步gal以及冰草的盐胁迫诱导基因等。向目标基因靠近,最终克隆基因。其主要步骤21从大的
6、基因组区域直接分离编码序列包括:(1)将目标基因定位在高密度的分子标真核生物基因组DNA中只有很小一部分记连锁群上;(2)利用PFGE将连锁标记的遗编码mRNA,而大部分则为内含子、外显子传图距转换成物理距离;(3)构建YAC文和重复序列,目前通过大规模基因组测序来寻库,找到含连锁标记的YAC克隆,并通过克找和克隆新基因尚不可行。在已有一些分离表隆的排序获得目标基因的DNA片段;(4)通达序列的方法中,cDNA捕捉法是较成功的一过转化和功能互补试验证实基因所在的DNA种方法,已用于许多基因的定位克隆。片段。如用该技
7、术已分离出番茄抗根结线虫(1)cDNA文库差示筛选法。这是一种直接mi基因和拟南芥菜抗细菌性茎腐病的RPMl分离组织或发育特异表达基因的方法。例如对基因等。于两种不同的组织细胞,先提取它们的poly+(A)mRNA,分别构建这两种组织的cDNA二、发展中的基因克隆新技术文库,然后以这些mRNA为模板,合成放射性11从研究缺失突变体的表型着手分离基标记的cDNA探针,再用这两种探针分别与一因类cDNA文库的两套重复考贝杂交,跟两种探(1)核DNA消减法。该法主要是利用许针都杂交的克隆是两种组织细胞中都表达的基多缺失突
8、变体与其未缺失的同源亲本只有1～因,而仅与一种探针杂交的克隆则是在一种组2个DNA片段的差异,通过将大量特殊标记织细胞中特异表达的mRNA,再对这样的克隆的突变体DNA与少量未缺失亲本DNA相混进行测序比较和鉴定,就可分离到这种组织特合,变性后在适当温度下复性,待反应体系中异表达的基因。用这种方法已分离到许多根茎的单链DNA重新配对成双链后,除去标记的叶和生
