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1、GBclonart基因克隆技术191
2、GenebankBiosciencesProprietary&Confidential
3、4/23/2012传统的分子克隆方法TA克隆限制性酶切克隆平滑末端克隆缺点：连接效率低耗时较长需要特定限制性酶切位点202
4、GenebankBiosciencesProprietary&Confidential
5、4/23/2012April23,2012GBclonart克隆技术的优点:任意载体任意基因片段不附加任何多余序列不受限制性内切酶酶切位点的限制213
6、GenebankBiosciencesProprietary&Confidenti
7、al
8、4/23/2012April23,2012GBclonart基因克隆技术原理示意图4250℃，30min单管反应GBclonart是一种快速、简单、高效的基因克隆技术！224
9、GenebankBiosciencesProprietary&Confidential
10、4/23/2012GBclonart基因克隆特点1.连接效率很高当前产品质量不符合要求，特别是buffer对连接的效率影响特别大，还有好多奸商购进别的公司的产品然后回来稀释卖出。2.背景低T4连接有时候背景很高，如果遇到特别的基因还很难连接进去，而LIC连接要对载体进行特殊的改造，这样对一些特殊的构建就有一定
11、的局限性，而GBclonart可以做到克服这样的困难。3.特殊连接这种方法，对于一些特殊的链接特别有帮助，如你片段里有很多酶切位点，你在苦苦需找用什么酶切的时候，浪费了你的好多脑细胞，而这种方法的好处是不用考虑你片段有什么酶切位点，只要考虑你在载体什么位点插入就可以了。4.多片段的链接5
12、GenebankBiosciencesProprietary&Confidential
13、4/23/2012克隆成功的关键线性化载体制备引物设计、PCR条件克隆反应设置克隆感受态细胞的选择选用质量好的胶回收或PCR纯化试剂盒6
14、GenebankBiosciencesPropriet
15、ary&Confidential
16、4/23/2012载体线性化:双酶切处理PCR扩增采用酶切或PCR扩增方法将载体线性化。质粒的线性化不彻底将导致阴性克隆的产生，所以一般建议通过双酶切。如使用PCR扩增获得线性化质粒，所用的酶应选用高保真酶（如Pfu酶）。7
17、GenebankBiosciencesProprietary&Confidential
18、4/23/2012April23,2012引物设计要点：1)引物的5’末端必须包含与载体末端相同的15个碱基序列2)引物的3’末端必须包含与目的基因片段相互补的特异碱基序列8
19、GenebankBiosciencesProprieta
20、ry&Confidential
21、4/23/2012克隆策略——对PCR片段的处理PCR产物有无杂带？有无引物二聚体？均有或有杂带无杂带，有引物二聚体GelExtractionKitPCRPurificationKit均无基因克隆、转化9
22、GenebankBiosciencesProprietary&Confidential
23、4/23/2012Gbclonart重组反应目的基因片段线性化载体GBclonart重组反应42℃30min反应液直接转化重组酶体系GBclonart反应液15μl重组反应：线性化载体xμlPCR片段xμl———总体积20μl10
24、GenebankBio
25、sciencesProprietary&Confidential
26、4/23/2012GBclonart无缝克隆结果：阳性I.线性化载体II.PCR片段III.反应产物阴性对照GBclonart反应液15μl线性化载体xμlPCR片段xμl———总体积20μl11
27、GenebankBiosciencesProprietary&Confidential
28、4/23/2012GBclonart无缝克隆注意事项：如何选择PCR酶？使用任何PCR酶都可以，但推荐使用高保真Pfu酶。PCR产物的结构有限制吗？没有特别的限制。PCR产物末端有无A尾都能使用。载体末端的结构有限制吗？没有特别
29、的限制。载体末端是平滑末端或是粘性末端都能使用。引物附加序列如果不是15个碱基可以吗？引物附加序列为15～20个碱基都可以。GBclonart试剂盒的保存应注意什么？-20℃或-80℃保存。12
30、GenebankBiosciencesProprietary&Confidential
31、4/23/2012
