资源描述：
《五种基因克隆技术》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、生物技术通报·国内信息·BIOTECHNOLOGYBULLETIN2002年第6期国内信息五种基因克隆技术经华中农业大学周国岭先生对国内外64篇有关基因克隆技术的论文概括和分析,当前基因克隆技术主要有5个类别,即体位克隆或状态克隆、转位或转DNA标记法、同系位候选基因法、快捷顺序标记法、差接式快捷基因克隆法等。1体位克隆或状态克隆首先将目的基因精确定位于分子标记连锁图上,用连锁标记筛选大片段YAC,BAC,TAC,PAC或Cos2mid等文库,构建含目的基因区的精细物理图谱,采用染色体操作法逐步接近目的基因,如拟南芥的WIG2GUM基因克隆,人的NPC
2、1基因克隆。若侧翼标记与目的基因连锁非常紧密,就可获得包含目的基因的大片段克隆。将此作亚克隆分析或作探针筛选DNA文库,并将目的基因定位于一个较小的DNA片段上,再作序列分析与功能鉴定;若从DNA文库中取BAC或PAC克隆末端序列分离体位克隆,利用BACP或PAC载体特有酶切位点NotI或sfiI和BAC片段中多酶切位点EcoRV,HpaI,StuI,XmnI进行双酶切再与质粒体连接,并用PCR来分离,则对BAC长链末端序列的分析和鉴定就更快速而高效。体位克隆或状态克隆曾用于分离与拟南芥种子形成和发芽相关的脱落酸信号传导基因ABI3、拟南芥ω-3脂肪酸
3、脱饱和酶基因FAD3、番茄抗霜霉病基因Pto、水稻抗白叶枯病基因XaZ1、小麦抗线虫基因Cre3以及200多个与人遗传性疾病相关基因的克隆。这一类别的克隆虽然作用很大,但由于需要构建基因组文库,建立饱和分子标记连锁图,要完善遗传转化体系,还要作大量测序工作,故此法投资较大,应用也有一定的局限性。但随着比较基因组学的发展,可利用同科异种间染色体共线性,通过比较基因组分析和染色体的稳定性,可将物种性状基因或分子标记直接定位于该分子标记连锁图中。如将小麦控制开花基因(Vrn)和水稻控制谷粒硬度基因(Ha)定位于第5组染色体上;又如利用水稻图谱信息筛选水稻和小
4、麦同线区的BAC或YAC测序和搜索候选基因。也还有较多的将QTL定位于分子标记连锁图上,借鉴体位或状态克隆法分离贡献率大的QTL来改良某些不良性状而适合现代农业的要求。2转位或转DNA标记法此法有五大基本程序,即首先进行突变体的诱变和鉴定;第二用转位或转DNA作标记DNA制成探针或引物筛选突变体基因组文库;第三用反义PCR技术分离出标记DNA两侧的目的基因部分序列;第四依据序列设计探针或引物筛选野生型基因组文库,并分离出完整的基因;第五用基因互补测验手段检测此法的功能。利用此法可克隆到玉米抗圆斑病基因HML,利用其AC/DS系统克隆到番茄抗叶霉病基因C
5、f-9,利用其En/Spm系统克隆到拟南芥的1个雄性不育基因,利用其Mutator系统克隆到玉米T-胞质中1个核恢复基因rf2,还可利用此法克隆到1个调节花器官发育的转录因子基因AG和拟南芥中1个抗线虫有关的基因。由于此法多用于异源植物,转位频率不高,拷贝数过多,易使诱变频率很低,难以获得转位突变体,而亲本所含转位或通过转基因或杂交进行转位才能引入,故此法有其局限性。特别对特定环境或特定发育阶段有突变表型基因或和大基因组中以基因家族形式存在与有功能补偿的部分基因家族。在转位过程中虽然发生插入突变,但不易看到突变表型。这也使转位或转DNA标记法仅限于分离
6、克隆那些有明显插入突变表2002年第6期生物技术通报BiotechnologyBulletin47型的基因。为此,此法发展成转位收集或俘获的无表型突变基因,包括增强子俘获和基因俘获两种。当前由于DNA测序技术飞快发展,大量基因序列信息和未知功能的基因被发现,利用转位DNA标记法鉴定基因生物功能的技术更加广泛。3同系位候选基因法为同源序列候选基因法,根据基因家族各成员间保守氨基酸序列设计引物,以此对含有目的基因DNA文库用PCR扩增,再扩增、克隆和功能鉴定。对植物抗病基因所具有保守氨基酸序列(核苷酸结合位点NBS、富亮氨酸重复序列LRR、丝氨酸苏氨酸蛋白
7、激酶STK、亮氨酸拉链LZ和横跨膜结构TM等),设计引物扩增植物DNA文库,并从所获得的抗性克隆中找到一些新的抗性候选基因。诸如根据谷氨酸脱氢酶基因GDH结构中某些序列存在物种中的保守性设计引物,经RT-PCR扩增产物制备探针筛选龙须草cDNA文库,可获得GDH的整个cDNA;根据高度同源性基因,可直接制备探针作杂交筛选出另一物种DNA文库,再用豌豆淀粉合成酶SSⅡ的cDNA作探针筛选小麦的cDNA文库,可获得小麦SSⅡa的cDNA;根据红海鲷和红鳟鱼的生长激素GH基因的cDNA筛选gsb的cDNA文库,获得gsbGH的cDNA克隆;还根据gsbGH的
8、cDNA筛选gsb的基因组文库,克隆出gsbGH基因。对此法,国内外生物技术学者虽然广泛重视,
