电子克隆技术及其在植物基因工程中的应用

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1、第37卷第3期东北农业大学学报37(3):403~4082006年6月JournalofNortheastAgriculturalUniversityJune2006文章编号1005-936（92006）03-0403-06电子克隆技术及其在植物基因工程中的应用*王冬冬,朱延明,李勇,李杰,柏锡（东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨150030）摘要：电子克隆是随着基因组计划和EST计划的实施而发展起来的,是利用生物信息学手段进行基因克隆的新方法。它具有投入低、速度快、技术要求低和针对性强等优点。因此,电子克隆技术必将成为

2、植物基因工程中获得新基因的重要手段。阐述了电子克隆应用所依据的数据库与生物信息资源,介绍了利用电子克隆获得功能基因的方法,及其在植物基因工程中的应用现状与前景。关键词：电子克隆;植物基因工程;表达序列标签EST;生物信息学中图分类号：Q785;Q943.2文献标识码：A电子克隆(insilicocloning)是近年来伴随着基因的研究内容之一。生物信息学资源是由数据库、计组计划和EST计划发展起来的基因克隆新方法。算机网络和应用软件三大部分组成。而电子克隆的电子克隆的技术原理是利用日益发展的生物信息应用即是基于这三部分生物信

3、息学资源而展开的。学技术,借助电子计算机的巨大运算能力,通过它是利用计算机技术,依托现有的网络资源(ESTEST或基因组的序列组装和拼接,利用RT-PCR的数据库、核苷酸数据库、蛋白质数据库、基因组数方法快速地获得新基因。国际上Boguski等学者在据库等),采用生物信息学方法(包括同源性检索、1994年开始利用电子克隆方法发现新基因,中国聚类、序列拼装等),通过EST或基因组的序列组科学院生物物理研究所陈润生研究组在1996也开装和拼接,利用RT-PCR快速地获得部分乃至全[1]始了对电子克隆的研究。长cDNA序列的方法。

4、电子克隆技术应用的前提条件要具备拟研物1.2电子克隆的实施方案种的丰富核酸序列信息,其他物种的相关基因的首先,在数据库或PubMed中获得感兴趣的信息,以及强大的计算机硬件和相关生物信息学cDNA或氨基酸序列,基于EST和基因组信息两种分析软件。基因组和EST资料的丰富程度决定了数据资源,利用上述得到的已知基因序列实施电子电子克隆得以在人类、小鼠等生物中广泛应用。克隆有以下两种方案。由于受到序列资料的限制,植物基因的电子克隆利用EST数据库信息资料:①利用序列同源还鲜有报道。但随着植物基因组计划和功能基因性比较软件(如Bla

5、st软件)将种子序列对库检索;组学的发展,电子克隆在植物基因工程研究中必②从数据库中挑选出全部相关序列;③对所有序列将发挥出巨大的功用。进行片段整合分析(即Contig分析),形成延伸后的序列,称新生序列。随后,将此新生序列作为种子1电子克隆技术及其依托的生物信序列重复进行上述三步过程,直至新生序列不能被息学资源进一步延伸为止,通过完整性分析即获得了全长的[2-3]新基因序列。见图1。1.1电子克隆的基本原理利用基因组信息资料:把作为信息探针的氨基利用电子克隆方法获得新基因是生物信息学酸或核苷酸序列在NCBI网站中对特定物种

6、各基因收稿日期：2005-01-14组数据库进行BLAST分析,从结果中筛选出感兴基金项目：国家自然科学基金(30471059)趣的外显子序列,并通过链接得到其所在的基因组作者简介：王冬冬(1981-),女,黑龙江人,硕士研究生,研序列,同时根据比对的结果对基因组序列可能造成究方向为植物分子生物学与植物基因工程。*通讯作者E-mail:ymzhu2001@hotmail.com的移码测序错误进行修正;把这些感兴趣的外显子·404·东北农业大学学报第37卷序列按照其所在基因组上的位置依次进行直接连BLAST分析,检验其新颖性;

7、把筛选后的新基因接,或者把基因组序列提交到GenScan和序列提交到dbEST数据库做BLAST分析并延伸,GeneFinder等网站进行预测,得到可能的新基因序同时也是进一步确认其真实存在的可信度,并进行列。有时各外显子分别处于较短的尚未组装的基组织表达定位,为克隆该基因提供组织来源信息。因组序列中,也可按探针基因外显子顺序进行直最后根据最终的序列设计引物,进行RT-PCR实[4]接拼接;把可能的新基因序列基于核酸数据库做验得到新基因。见图2。感兴趣的EST序列感兴趣的外显子序列及基因组序列Blast(dbEST)cont

8、ig或BAC/PAC克隆相似的EST片段获得其侧翼基因组序列聚类,拼接,延伸序列重叠群(contig)重复Blast外显子预测,拼接不能再延伸的Contig可能的新基因序列分析完整性分析完整性获得全长cDNA序列获得基因全长序列RT-PCR、克隆、测序、功能鉴定RT-PCR、克隆、测序、功