抗菌肽及其在植物抗病基因工程中的应用

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1、抗菌肽及其在植物抗病基因工程中的应用汪小福1，2，高智谋1，陈锦清2（1安徽农业大学植保学院，合肥230036；2浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所，杭州310021）1抗菌肽的分类广义的抗菌肽(antibacterialpeptides)是指广泛存在于生物体内对生物体具有抵御外界微生物的侵害,清除体内突变细胞的一类小分子多肽，它们在动物的免疫细胞、空腔脏器粘膜、皮肤以及植物中都广泛存在。根据抗菌肽的来源不同可以将抗菌肽分为以下几类：1.1防御素是指吞噬细胞产生的一类具特征性β片层结构和广谱抗微生物活性的小分子多肽。防御素广义上代表一大类具广谱抗微生物活性并有特征性蛋白质结构的小

2、分子阳离子多肽(cationicpeptides)，但通常是指脊椎动物吞噬细胞产生的防御素，或称髓系防御素(myeloiddefensins)。1.2昆虫抗菌肽根据其结构与功能可大致分为4类：天蚕素类（Cecropins），昆虫防御素（insectdefensins），富含脯氨酸的抗菌肽(proline-richpeptides)和富含甘氨酸的抗菌肽(glycine-richpeptides)。（1）天蚕素类：天蚕素是最早发现的抗菌肽，它对革兰氏阳性菌和阴性菌都有较高的抗性。1980年Boman等首次分离到纯的天蚕素A和B。翌年，Boman又与Bennich等人合作测定了天蚕素A和B

3、的一级结构，随后在柞蚕肉蝇、烟草天蛾中都发现了天蚕素或类似天蚕素的抗菌肽。这些抗菌肽的分子结构相似：都有31-39个氨基酸残基组成；分子质量为4kDa左右；半胱氨酸(Cys)含量少，不能形成分子内二硫键；有强碱性的N端和疏水性强的C端；在肽的许多特定位置有较保守的残基，如2位具有色氨酸(Try)，5、8、9位具有1个或1对赖氨酸（Lys），11位具有天冬氨酸(Asn)，12位具有精氨酸(Arg)；有些位置尽管残基不同，但仍是保守替换。1988年，Halak等人利用二维核磁共振技术测定天蚕素A的三级结构。N端1-4位4个氨基酸是非螺旋化的。天蚕素A的分子结构含有2段α-螺旋。5-21位

4、为第1个α-螺旋，该螺旋中极性与非极性氨基酸含量相当，因此，该螺旋对水和脂都具有亲和性，称为双亲的α-螺旋。25-37位为第2个α-螺旋，其中疏水氨基酸含量高，故该α-螺旋疏水性强。22-24位形成一个Ala-Gly-Pro的结节部，这个结节部在其它细胞膜毒素(如pardaxin、melittin、alamethicin)中普遍存在。可以推知，此种结构与天蚕素的抗菌活性密切相关。此外，所有昆虫的抗菌肽都酰胺化，天蚕素类也不例外，其C端的酰胺化，对其广谱性极其重要。（2）昆虫防御素：第1种昆虫防御素由Masturyama于1988年在一种双翅目昆虫肉(Sarcophagaperegri

5、na)中发现。至今，昆虫纲中已有15大类30多种防御素被报道。发现有防御素的昆虫包括双翅目(5种)、鞘翅目（2种）、膜翅目（1种）、毛翅目（1种）、半翅目（1种）、蜻蜓目（1种）；但在鳞翅目昆虫尚未发现防御素。绝大多数昆虫防御素的分子质量为4kDa左右，由38-43个氨基酸残基组成。仅有1-2个例外：一种是肉蝇肽(sapecin_B)，由34个氨基酸残基组成；另一种是从膜翅目昆虫意大利蜂(Apismellifera)中得到的royalisin，由51个氨基酸残基组成。昆虫防御素都有1个静电荷，且氨基酸序列中都含6个位置很保守的Cys，能形成3个分子内二硫键。绿蝇防御素(phormia

6、defensin)是研究得最清楚的防御素。该分子由3个结构域组成：一个柔韧的N端环，一个亲水脂的α-螺旋中心，一个带有拟β转角反向平行的β片层。不同种类昆虫的防御素分子结构具有很大的同源性，其主要差异在N端环的大小。而且Cys-X-X-X-Cys或Cys-X-Cys(X代表任意氨基酸)结构普遍存在，使α-螺旋通过分子内二硫键得以稳定。昆虫防御素可以抗革兰氏阴性菌，而对革兰氏阳性菌几乎无作用。与哺乳动物防御素不同，昆虫防御素对真菌及真核细胞不起作用。（3）富含脯氨酸的抗菌肽：这是20世纪80年代才发现的一类新型的昆虫抗菌肽。1989年Casteels等首先从膜翅目的意大利蜂(A.mel

7、lifera)发现：这类抗菌肽都由15-34个氨基酸残基组成，其中，Pro质量分数在25℅以上，它们都带有正电荷，都含有Arg-Pro(R.P)或Lys-Pro(K.P)氨基酸对，有些带有典型的Arg-Pro-Arg(R.P.R)结构。但是这类抗菌肽除上述小分子肽类外，还包括一些分子量较大的肽，如双翅肽(diptericin)。在绿蝇、果蝇中都有双翅肽，都是由83个氨基酸残基组成的，一级结构相似，最大的特点是整个分子可分为2个明显的结构域。在N端是一个短的