何水林版基因工程第二章基因克隆的工具酶

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1、第二章　基因克隆的工具酶周毅峰2013春基因克隆的工具酶（instrumentalenzymeofgenecloning）:应用于基因克隆中的各种酶的总称。通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶叫做核酸酶。专门水解断裂RNA分子的叫做核糖核酸酶（RNase）特异水解断裂DNA分子的则叫做脱氧核糖核酸酶（DNase）从核酸分子的末端开始，一个核苷酸一个核苷酸地消化降解多核苷酸链，叫做核酸外切酶（exonuclease）从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫做核酸内切酶（endonuclease）1

2、限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)"forthediscoveryofrestrictionenzymesandtheirapplicationtoproblemsofmoleculargenetics"TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1978WernerArberSwitzerland1929~DanielNathansUSA1928~1999HamiltonO.SmithUSA1931~一类能从DNA分子中间水解磷酸二酯键,从而切断双链DNA的核酸水解酶。它们不同于一般的脱氧核糖核酸酶（DNase）

3、，它们的切点大多很严格，要求专一的核苷酸顺序─识别顺序。restrictionenzyme限制性核酸酶的发现,为基因结构、DNA碱基顺序分析和基因工程的研究开辟了途径。1.1寄主控制与修饰现象(Restrictionandmodification)Theopposingactivitiesofrestrictionandmodificationarethetwocomponentsofabacterialdefencemechanism.Restriction,orDNAcleavage,isthemeansbywhichthehostbacteriaprev

4、entsinfectionbybacterialviruses(bacteriophage).TheDNAoftheincomingphageisrecognisedas"foreign"andcleavedbyarestrictionendonuclease.在Ecoli.K上生长的λ噬体则表示为λ（K）。实验表明，用这种λ（K）噬菌体感染Ecoli.B，形成噬菌斑的效率就很低因此λ（K）噬菌体受到了B菌体的限制。Modification,DNAmethylation,isthemechanismbywhichthehostbacteriaprotectsi

5、tsownDNAfromcleavagebytherestrictionendonuclease.AmodificationmethyltransferasemethylatestheDNAatthesamerecognitionsequencethattherestrictionendonucleaseusestobindtotheDNApriortocleavage.Thisactivitydiscriminates"self"DNAfrom"foreign"DNA.Invivorestrictionofbacteriophagelambdabytwodi

6、fferentrestrictionsystems.Therestrictionlevelisshownasareductioninthenumberofplaquesproducedbythephage.Thetwoplatesattherightshowasignificantreductioninthenumberofplaquesduetorestrictionactivity.RestrictionModification1.2限制性内切酶的种类Ⅰ型的酶要求DNA分子上有特定的识别顺序，但是切点却不在此识别顺序之中，而与之有一定距离。在反应中，要求有

7、ATP和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。酶由不同的α、β、γ亚基组成。全酶兼有限制性内切酶的活性和甲基化酶的活性。按其性质可分为三大类Ⅲ型的酶与Ⅰ型的酶有相似特征，只是切点距识别顺序距离是严格的。限制性核酸酶在原核和真核细胞中都有发现不兼有甲基化酶的活性，细胞内另有独立的甲基化酶。它切断DNA时不需ATP，也不需SAM。它的切点是严格的，而且就在识别顺序之中。Ⅱ型的酶，独立的限制性核酸内切酶Ⅱ型的酶在蛋白质组成上比Ⅰ型、Ⅲ型要简单的多，它只有单一的亚基，以二体或四体发挥作用。1.3限制性核酸内切酶的命名属名种名株名Haemophilusinfluenzaed嗜血流

8、感杆菌d株HindIIIHindIII