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1、第二章基因工程的工具酶Chapter2EnzymesofGeneEngeneering第一节限制性内切核酸酶（RestrictionEndonuclease）能专一性识别双链DNA上的特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开。来源：细菌、霉菌和蓝藻功能：细胞内限制性修饰系统的一部分，可以降解“入侵”的外源DNA限制性内切酶作为细菌体内保护自身、避免被噬菌体入侵的作用机制。一、限制性内切酶的命名和种类1.命名：生物的属名的第一个字母和种名的第一、二个字母命名，菌株的代号的一个字母，和罗马数字表示。EcoRIEscherichi
2、a属名Coli种类Ry13株系编号第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株名；用罗马数字表示发现的先后次序。2.限制性内切酶的种类：平端5′突出粘端3′突出粘端识别序列：在双链DNA分子能够识别的特殊核苷酸序列;一般为4-8bp1）二重旋转对称识别序列（回文序列）3.限制酶的特点1).识别顺序和酶切位点①识别４-8个相连的核苷酸MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCC：PpuMIPuGG(A/T)CCPyNotIGCGGCCGC；SfiIGG
3、CCNNNNNGGCCCCGGN’N’N’N’N’CCGGFokI5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’外侧，产生５’-端突起２）富含ＧＣ３）对称性—双对称EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ2).末端种类１）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸PstI5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸EcoR
4、I5’-GAATTC-3’5’-GOHPAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAPHOG-5’３）平齐末端SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’４）非互补的粘性末端ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokIFokI5’-GGATG(Ｎ)9-3’5’-GGATG(N)93’-CCTAC(Ｎ)13-5’3’-CCTAC(N)13ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaIAvaI5’-CPyCGPuG-3’CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG５）相容
5、性末端如：BamHIGGATCCBglIIAGATCTMboI,Sau3AINGATCN上述几种限制酶产生的DNA片段仍可相连，由此形成的重组分子能被MboI和Sau3AI识别和酶切，但BamHI和BglII的识别机率只有1/16。BamHI+MboIA/C/G/TGATCT/C/G/ABamHI和BglII(AGATCT)两种酶产生的相容性末端，相连后不能为两种酶所识别和酶切。BamHI+BglIIA/GGATCT/C不同末端的连接特性:除第4种末端不能进行不同DNA分子或同种DNA分子不同切点产生的末端相连外，其余4种末端可以
6、相互连接。4.同尾酶(Isocaudamer)有些来源不同的限制酶，识别及切割序列各不相同，但却能产生出相同的粘性末端。MunI：5`-CAATTG-3`3`-GTTAAC-5`EcoRI：5`-GAATTC-3`3`-CTTAAG-5`5`-CAATTG-3`3`-GTTAAC-5`5`-GAATTC-3`3`-CTTAAG-5`重新连接后的序列：5`-CAATTC-3`3`-GTTAAG-5`两种同裂酶切割形成的DNA片段经连接后所形成的重组序列，能否被原来的限制酶所识别和切割？5.异源同序酶（Isoschizomer，同裂酶
7、）1.定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶2.特点：1）识别相同顺序2）切割位点的异同KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGG6.限制酶的星反应（Staractivity）1.特点:限制酶识别序列特异性降低2.发生星反应的限制酶和条件（见下页）3.星反应的利用和避免表1具有星反应的限制性内切酶与条件限制酶 诱发星活性的条件a识别序列AvaI1,2,4BamHI1-5,8GGATCN,GPuATCCBstI2,4BsuI2,4,6EcoRI1,2,4-6NAATTNHae
8、Ⅲ2,4HhaI2,4,7HindⅢ6HpaI1,2,4PstI1,2,4,7PvuⅡ2,4SalI1,2,4,7ScaI4-6,8SstⅡ2,4XbaI2,4,7a.1：亚乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA
