基因工程工具酶.ppt

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1、基因工程的有力工具—酶基因的重组与分离，涉及一系列相关的酶促反应，其涉及的酶类主要有：限制性内切酶连接酶聚合酶修饰酶核酸酶9/1/20211基因工程中常用的工具酶9/1/20212第二章基因工程工具酶第—节限制性核酸内切酶第二节DNA连接酶第三节DNA聚合酶第四节修饰酶第五节核酸酶9/1/20213第一节限制性核酸内切酶1、宿主的限制和修饰现象2、限制性核酸内切酶的类型3、限制性核酸内切酶的命名4、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性5、Ⅱ型限制性核酸内切酶的酶切反应6、影响限制性核酸内切酶活性的因素9/1/20214第—节限制性核酸内切酶1、宿主的限制和修饰现象E.ColiB

2、E.ColiKλ(B)修饰λ(K)修饰（限制）10-4（限制）4×10-4119/1/202151、宿主的限制和修饰现象寄主细胞控制的限制与修饰（R/M体系）宿主控制限制在大肠杆菌K菌株上生长的λ噬体则表示为λ（K）。实验表明，用这种λ（K）噬菌体感染大肠杆菌B菌株，形成噬菌斑的效率就很低，因此我们说λ（K）噬菌体受到了B菌体的限制。9/1/20216宿主控制修饰在这些稀有的由λ（B）形成的噬菌斑中的噬菌群体，则已经发生了某些变化。用这些变化了的λ（B）噬菌体再感染B菌株，它们就可以在B菌株上有效地生长。如此由第二个寄主菌株（大肠杆菌B株）赋予λ噬菌体的这种非遗传化，使得它再感染时

3、能够有效地生长，而没有再次受到限制的现象，称之为修饰。无论是限制还是修饰，都是由寄主控制的，我们统称为寄主控制的限制与修饰现象。9/1/20217(B)(B)酶切位点不被修饰噬菌体DNA被切割酶切位点被修饰Methylation基因组DNA不被切割1968年，Meselson和Yuan从大肠杆菌K和B中发现了I型限制性核酸内切酶；1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离纯化了第一个II型限制性核酸内切酶HindII，使得DNA分子的体外精确切割成为可能。限制—修饰的酶学假说9/1/20218第—节限制性核酸内切酶1.1限制（Restriction）宿主DNA中的

4、特定序列被甲基化，无法被自身的限制酶切割分解，而无甲基化的外源DNA将被宿主的限制酶摧毀，即限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。9/1/202191.2修饰（Modification）细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割①Dam甲基化酶②Dcm甲基化酶9/1/2021101.3限制与修饰现象意义几乎所有的限制性内切酶都要和能识别而且甲基化相同的DNA位点的甲基化酶共同作用。这两个酶——限制性内切酶和甲基化酶一起称为限制—修饰系统(R-M系统)。在甲基化后，DNA位点被保护起来，所以宿主细胞中甲基化的DNA能够不被限制性内切核

5、酸酶消化。寄主控制的限制与修饰是一种广泛的过程，它存在有两方面的作用。保护自身的DNA不受限制破坏外源DNA使之迅速降解9/1/202111第一节限制性核酸内切酶1、宿主的限制和修饰现象2、限制性核酸内切酶的类型3、限制性核酸内切酶的命名4、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性5、Ⅱ型限制性核酸内切酶的酶切反应6、影响限制性核酸内切酶活性的因素9/1/202112第—节限制性核酸内切酶2限制性核酸内切酶的类型2.1限制性核酸内切酶的概念限制性核酸内切酶（Restrictionendonucleases）:是一类能够识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并能精确特异地切割双链DNA分子

6、的核酸内切酶。已经从近300中微生物中分离出了500余种限制性核酸内切酶。2006年2月共发现3773种限制性内切酶，I、II、III型各有68、3692、10种，甲基化指导的3种,商品化的609种,II型中共有223种特异性。9/1/202113第—节限制性核酸内切酶2.2限制性核酸内切酶的分类2.2.1Ⅰ型限制性酶最早(1968)发现的一种复合功能酶，具修饰和切割DNA两种特性。该酶的识别位点上两条DNA链均未甲基化，就行使内切酶功能，并在切割DNA的同时或以后转变为ATP酶；如果位点上只有一条链被甲基化，则发挥修饰功能，使另一条链也甲基化；若位点两条链均已甲基化，就与位点解离

7、。9/1/202114第—节限制性核酸内切酶它的显著特点：是能识别DNA分子中特定的核苷酸序列，但切割作用却是随机进行的，一般在距离识别位点上千碱基对以外的随机位置上切割，不产生特异片段。因此，I型限制性核酸内切酶在基因操作中没有实用价值。9/1/2021152.2.2Ⅱ型限制性酶1970从流感嗜血杆菌分离出特点是只有一种多肽，它与甲基化酶是分开的两种蛋白质。Ⅱ型限制性核酸内切酶仅需要Mg2+，可识别双链DNA分子上的特定序列，并且其切割位点与识别位点重叠或靠近，产生