基因工程工具酶简化

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1、第二章基因工程的工具酶一、限制性核酸内切酶的发现第一节限制性核酸内切酶限制(restriction)修饰(modification)限制性核酸内切酶的生物学功能：自我保护功能(只切外来的DNA，自身DNA被甲基化后切不动)核酸酶：水解断裂多核苷酸链的两个相邻核苷酸的3,5磷酸二酯键核糖核酸酶（RNase）：脱氧核糖核酸酶（DNase）：核酸外切酶（exonuclease）：核酸内切酶（endonuclease）：限制性核酸内切酶：二、限制性核酸内切酶的分类主要特性I型II型III型限制修饰多功能单功能双功能蛋白结构异源三聚体同

2、源二聚体异源二聚体辅助因子ATP,Mg2+,SAMMg2+ATP,Mg2+,SAM识别序列特异性非对称性序列特异性4-8bp旋转对称序列特异性非对称性序列切割位点距识别序列1kb处随机性切割识别序列内或附近特异性切割距识别序列下游24-26bp用途无应用价值应用广泛无应用价值平末端粘性末端1单位酶活性(1unit1U)：在最适反应条件下1小时完全切割1ugλDNA样品的酶量。同序同裂酶(识别及酶切位点相同):同序异裂酶(识别位点相同但酶切位点不同):同尾酶(酶切位点不同但产生相同的粘性末端):酶切位点的计算：四核苷酸识别序列：

3、44=256六核苷酸识别序列：46=40962个假设：a随机排列；bGC含量50%如：用BglⅡ(A/GATC/T)酶切λDNA49Kb）:理论上的切点数：49000/4096=12个实际情况？三、限制性核酸内切酶的命名1973年H.Smith和D.Nathans提议①每一种酶都由产生并纯化生出该酶的细菌的种属名中的三个英文字母合起来代表：第一个字母采用细菌属名的第一个字母大写；第二和第三个字母小写，采用细菌种名的前两个字母；如大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示，代表从大肠杆菌中分离出的限制性内切酶。②第四

4、个字母表示菌株的类型（大小写均有），如EcoR中的R代表大肠杆菌R株。③如果一个菌株有几种限制酶，则在代表菌株的字母后用罗马数字表示。思考题：流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）d菌株有三种限制酶，分别怎么表示？HindI、HindII、HindIIIBaciUusamyloliquefaciensHStreptomycesalbusI一、天然DNA的制备1、天然DNA的来源①染色体DNA②病毒和噬菌体DNA③质粒DNA④线粒体和叶绿体DNA第二节DNA分子片段化2、天然DNA的提取①准备生物材料。②裂解

5、细胞。③分离和抽提DNA。二、DNA的纯化琼脂糖凝胶电泳洗脱法适用于小剂量DNA的纯化和酶切DNA片段的回收。三、DNA的浓缩乙醇沉淀法在含一价阳离子的DNA溶液中加入2体积的无水乙醇，使DNA沉淀（-20℃，时间在30min以上）通过离心收集沉淀的DNA溶于适量的TE缓冲液或无菌水中四、限制性核酸内切酶反应1、限制性核酸内切酶反应缓冲液2、单酶切法若DNA样品是环状DNA分子，完全酶切后，产生与识别序列数（n）相同的DNA片段数，并且DNA片段的两末端相同若DNA样品本来就是线形DNA片段，完全酶切的结果，产生n＋1个DNA

6、片段数，其中有两个片段的一端仍保留原来的末端3、双酶切法应先用需要较低盐浓度缓冲液的酶进行切割，然后调节缓冲液的盐浓度，再加入需要较高盐浓度缓冲液的酶进行切割。如果两种限制性核酸内切酶的最适反应温度不同，则应先用最适反应温度较低的酶进行切割，升温后再加入第二种酶进行切割。若两种限制性核酸内切酶的反应系统相差很大，会明显影响双酶切结果，则可以在第一种酶切割后，经过凝胶电泳回收需要的DNA片段，再选用合适的反应系统，进行第二种限制性核酸内切酶的切割。4、部分酶切当某种限制性核酸内切酶在待切割的DNA分子上有多个识别序列，并且其中一

7、个识别序列正好在切割后需要回收待用的DNA片段上，若完全酶切，势必将此待用的DNA片段从中切断。在此情况下，对DNA样品进行部分酶切，经过凝胶电泳，根据待用DNA片段的大小，可回收待用的DNA片段5、DNA分子的限制性图谱五、影响核酸内切限制酶活性的因素（1）DNA的纯度（2）DNA的甲基化程度（3）酶切消化反应的温度（4）DNA的分子结构（5）星星活性第三节DNA聚合酶一、DNA聚合酶概述DNA聚合酶（polymerase）：以DNA或RNA为模板催化合成互补新链的酶。大多需要一个引物来起始互补新链的合成。间断(discon

8、tinuity)：在DNA的一条链上某一位置两个相邻的核苷酸之间的磷酸二酯键发生断裂。缺刻(nick)：某一位置上丢失了一个或几个核苷酸。（1）以DNA聚合酶I为代表的“合成型”（2）以klenow聚合酶为代表，只有聚合酶活性和部分外切酶的活性（3）逆转录酶类，以RNA作