基因工程载体和工具酶

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1、（6）表达型质粒载体主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻译信号控制之下。注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。复制起始点ORI、选择标记、多克隆位点MCS2）大肠杆菌操纵子元件阻遏基因I操纵基因O启动基因P核糖体结合位点序列（SD）转录终止信号区。1）普通载体元件①表达载体的结构大肠杆菌乳糖操纵子的调控操纵子与操纵子模型操纵子学说/操纵子模型：F.JacobJ.Mond（1960）E.colilacoperon(1965诺贝尔医学生

2、理学奖)操纵子：核酸分子上调控基因转录活性的基本单元，由结构基因、操作子（O）和启动子（P）组成。转录、翻译、合成蛋白结合调节蛋白结合RNA聚合酶promoterstructuralgenesoperator启动基因操纵基因结构基因操纵子(operon)模型调控（节）蛋白操纵子RNARPOstructuralgenesDNAProtein＋正调控（positiveregulation)－负调控(negativeregulation)调控蛋白的作用机制注：R：RegulatorP：PromoterO：Operator正调控

3、系统中的正调控蛋白又被称为无辅基诱导蛋白（apoinducer)负调控系统中的负调控蛋白又被称为阻遏蛋白（repressor)(四)经典的大肠杆菌质粒载体1.pSC101第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体。（1）类型天然质粒，属低拷贝型。（2）长度9.09kb。（3）选择标记四环素抗性Tetr6个克隆位点：EcoRI、XhoI、PvuI、HindIII、BamHI、SalI主要使用EcoRI。（其中HindIII、BamHI、SalI3个位于选择标记Tetr的内部）（4）克隆位点2.ColE1（1）类型天然质粒，

4、属高拷贝型。（2）长度6.3kb。（3）选择标记大肠杆菌素（colicin）E1对E1免疫的基因（immE1）特点是在培养基中加入氯霉素抑制细菌蛋白质合成后，质粒仍然能复制达到每个细胞1000-3000拷贝之多！①colicinE1基因的结构ceaimmkil结构基因免疫基因溶菌基因②杀死不含有ColE1细菌的原因cea+kil基因产物③不被其他细菌的colicinE1所杀死的原因imm基因EcoRI位于E1内部，插入外源DNA会导致E1失活，使受体菌不能合成E1（ColE1-），但仍然表现出对E1免疫型（ImmE1+）

5、。EcoRI（4）克隆位点ColicinE1外源DNA无Colicin3.pBR322：F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工构建载体。“P”表示是一种质粒(plasmid)；“BR”表示两位主要构建者姓氏的头一个字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”;“322”表示实验编号。pSP2124质粒的Ampr基因（1）元件来源①复制起点oripMB1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点②Ampr基因③Tetr基因pSC101的Tetr基因。（2）长度4361bp（3）选择标记氨苄青霉素和四环

6、素抗性。（4）克隆位点其中9个会导致Tetr基因失活（如BamHI、HindⅢ、SalI）；3个会导致Ampr基因失活（ScaI、PvuI、PstI）。24个克隆位点。（5）pBR322的优点①双抗菌素抗性选择标记插入失活，分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞在Amp或Tet中都死亡。获得载体的寄主细胞在Amp或Tet其中之一中死亡。外源基因BamHIAmp中存活但在Tet中死亡外源基因PstITet中存活但在Amp中死亡每个细胞可达1000~3000copy④安全失去了转移蛋白基因mob（mobilizati

7、on）。不能通过接合转移。③高拷贝数②分子小，克隆能力大载体越小越好。>10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。保留了转移蛋白（mob）的作用位点。（6）pBR322的缺点能够被ColK质粒编码的mob蛋白识别，如果再有F质粒的参与，就有可能转移！①删除mob识别位点（如质粒pBR327、pAT153等）。pAT153：从pBR322上切去HaeII片断，既除去了mob识别位点，又增加质粒的拷贝数。（7）PBR322的改进pBR325：在pBR322位点上接入一段来自噬菌体PICm的HaeII酶切片断（带有氯霉素抗性基因c

8、mlr）。cmlr上也带一个EcoRI位点。使EcoRI也成为插入失活型位点。②改造EcoRI位点4.pUC系列UniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造而成。属正选择载体。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18