基因工程的载体和工具酶

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1、第二节基因工程的载体和工具酶基因工程的工具酶基因工程的载体一基因工程的载体载体的功能及特征质粒（plasmid）噬菌体DNA1、载体的功能及特征●载体的功能■运送外源基因高效转入受体细胞■为外源基因提供复制能力或整合能力■为外源基因的扩增或表达提供必要的条件●载体应具备的条件■具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）■具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点■具有较高的外源DNA的载装能力■具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点（多克隆位点）■具有合适的筛选标记2、质粒●质粒：是能自主复制的双链

2、环状DNA分子，它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在，一个质粒就是一个DNA分子，1kb--200kb。●质粒的基本特征■质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制，质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系，根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒1-3拷贝松弛型复制控制的质粒10-60拷贝■质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。☆ColE1、pMB1拥有相

3、似的复制子结构，彼此不相容以大肠杆菌的质粒为例：■质粒的可转移性野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状。☆这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义■携带特殊的遗传标记●重要的大肠杆菌质粒载体(Boyer)pBR322：松弛型复制氯霉素可扩增拷贝数50-100/cell用于基因克隆OripUC18/19：拷贝数2000-3000/cell装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ用于基因克隆pUC18/19：正选择标记lacZ’的显色原理

4、ab5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷pUC18/19X-galb-半乳糖苷酶的a-肽段lacZ’MCSPlac根据蓝白斑选择转化子●质粒DNA的分离纯化碱裂解法■实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：氯化铯密度梯度离心法沸水浴法proteinsL-DNAcccDNARNAsocDNAcccDNAL-DNA1、用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体，加溶菌酶裂解细菌细胞壁；2、加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物；3、加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质；4、

5、离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质；5、乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA；6、用无DNase的RNase去除残余的RNA（选择）。碱裂解法：2、噬菌体或病毒DNA噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增大肠杆菌的

6、l噬菌体DNAλ噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于cDNA文库或基因组文库的构建。l-DNA载体的构建：缩短长度野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体：插入型载体取代型载体l-DNA载体的构建：插入型载体载体长度37kb

7、插入片段大小：0-14kb插入位点插入片段体外包装体外包装如：lgt系列载体l-DNA载体的构建：取代型载体(Blattener)最小装载长度10kb载体长度26kb最大装载长度25kb插入片段插入片段体外包装体外包装如：Charon系列载体l-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1-2个。为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一酶切位点。l-DNA载体的构建：加装选择标记与质粒不同，野生型l-

8、DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是l-DNA克隆载体构建的重要内容l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：免疫功能类标记颜色反应类标记l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌。l-DNA载体的装载能力为25kb，远远大于质粒的装载量。l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因。l-DNA作为载体的优点：l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。用于体外包装的蛋