基因工程操作的工具酶

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1、第二章基因工程操作的工具酶2.1基因工程工具酶1.工具酶的概念2.限制性内切酶3.DNA聚合酶4DNA连接酶5.碱性磷酸酶6末端转移酶7核酸酶S18T4多核苷酸激酶1.工具酶的概念应用与基因工程的各种酶的总称.切:连:修饰:2.限制性内切酶主要从细菌中分离得到，核酸水解酶。酶识别特定的核苷酸顺序，但在细菌本身的DNA中，这些顺序已被甲基化修饰，因而不被水解；这些酶仅限于水解外源DNA以保护自身，故称之为“限制性”酶。以内切方式水解DNA，产物的5’为p，3’为OH。限制性内切酶的发现Luria和

2、Human发现：λ．K噬菌体---------------Ecoliλ．B噬菌体----------------Ecoli广泛存在于原核细菌。由宿主控制的对外源DNA的限制(restriction)和对内源DNA的修饰(modification)现象称为宿主细胞的限制和修饰作用。作用：一：保护自身DNA不受限制；二：破坏入侵的外源DNA，使之降解。Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种酶，能够特异性的切割DNA，这个酶被命名为HindI,这是第一个分离到的限制性内切核酸酶。限制性内切

3、酶的定义指限制修饰系统中的一个组成部分，具有识别双链DNA分子中的某种特定核酸序列，并由此切割DNA双链结构的酶统称为限制性内切酶。限制性内切酶分类根据限制性内切酶的识别顺序与切割位置是否一致，将它们分成三类。Ⅰ型型限制性内切酶：Ⅱ型限制性内切酶：Ⅲ型限制性内切酶：I型限制性核酸内切酶具有核酸内切酶、甲基化酶、ATP酶和DNA解旋酶四种活性，其切割作用是随机进行的，一般在距离识别位点上千碱基对以外的随机位置上切割，不产生特异片段。Ⅲ型限制性核酸内切酶是由两个亚基组成的蛋白质复合物，具有限制与修饰

4、双重作用。切割位点则在识别序列一侧的若干碱基对处，无序列特异性，只与识别位点的距离有关，而且不同酶的这一距离不同。Ⅱ型限制性内切酶：3个基本的特征：①在DNA分子双链的特异性识别序列部位切割DNA分子；识别序列的碱基数一般为4、6、8个bp,识别位点经常是一种回文序列的DNA.限制性酶的识别序列一般为4~8个核苷酸，这些序列大多呈回纹结构。EcoRⅠ识别6个核苷酸序列，在特定的G-A之间切割DNA分子。5’…G↓A–A-T–T–C…3’3’…C–T–T–A–A↑G…5’PstⅠ酶切5’…C–T–

5、G–C–A↓G…3’3’…G↑A–C–G–T–C…5’SmaⅠ酶切5’…C–C–C↓G–G–G…3’3’…G–G–G↑C–C–C…5’BalⅠ酶切识别6个核苷酸的序列，在特定的G-C之间切割DNA分子：5’…T–G–G↓C–C–A…3’3’…G–A–C↑G–G–T…5’②2个单链断裂部位在DNA分子上的分布通常不是彼此直接相对的；PstⅠ酶切5’…C–T–G–C–A↓G…3’3’…G↑A–C–G–T–C…5’③断裂结果形成的DNA片段往往具有互补的单链延伸末端。EcoRⅠ：5’…G↓A–A-T–

6、T–C…3’3’…C–T–T–A–A↑G…5’限制性核酸内切酶的命名按酶来源菌的属、种名而定，取属名的第一个字母与种名的头两个字母组成的三个斜体字母作略语表示；如有株名，再加上一个字母，其后再按发现的先后写上罗马数字。例如：从流感嗜血杆菌d株（Haemophilusinfluenzaed）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ。常见的限制性内切酶限制性核酸内切酶名称识别序列和切割点EcoRⅠG↓AATTCHindⅡGTPy↓PuACHindⅢA↓AGCTTBsuR

7、IGG↓CCPstⅠCTGCA↓GSmaⅠCCC↓GGGXbaⅠT↓CTAGAXhoⅠC↓TCGAGBamHⅠG↓GATCCNotⅠGC↓GGCCGC5’–GAATTC-3’EcoRIGAATTC5’粘端3’–CTTAAG-5’CTTAAG5’–CTCGAG-3’PstICTCGAG3’–GAGCTC-5’GAGCTC3’粘端5’–CCCGGG-3’SmaICCCGGG平末端3’–GGGCCC-5’GGGCCC限制酶产生末端的连接a、粘性末端互补-CTCGAAGCTTGTTC--GGCAAGCT

8、TACT--GAGCTTCGAACAAG--CCGTTCGAATGAHindIII酶解HindIII酶解-CTCGA--AGCTTGTTC--GGCA--AGCTTACT--GAGCTTCGA--ACAAG--CCGTTCGA--ATGA-混合退火-GGCAAGCTTGTTC--CCGTTCGAACAAG-切口b、不匹配末端连接-AAGCTT--TCTAGA--TTCGAA--AGATCTHindIIIXbaI-ACTAGA--TTCGATKlenow酶填补-AAGCTAGA--TTCGATCT