基因工程常用的工具酶

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1、第二章基因工程常用的工具酶第一节限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶：简称限制酶。是一类能识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶20世纪50年代发现：λ噬菌体E.coliBPFU10-4E.coliBPFU1λ噬菌体DNA被降解DNA被修饰E.coliB限制性核酸内切酶：降解外来DNA防御修饰酶：DNA甲基化保护寄主细胞控制的限制与修饰系统（R/M体系）！一、限制酶的种类限制修饰活性酶蛋白结构相对分子质量切割位点切割作用辅助因子实用性代表Ι型酶Ⅱ型酶Ⅲ型酶同时存在单独存在同时存在多亚基结构单亚基结构两个亚基30万d

2、al2-10万dalΙ、Ⅱ之间与识别位点不一致与识别位点一致与识别位点不一致Mg2+、ATP、SAMMg2+Mg2+、SAM低高低EcoK、EcoBHindⅡEcoPΙ二、限制酶的命名命名原则限制酶寄主微生物属名头字母（大写）和种名前两字母（小写）表示寄主物种菌株名位于其后罗马数字表示同一寄主菌株的不同限制修饰系统HaemophilusinfluenzaedHindΙ、HindⅡ、HindⅢ属名种名株名不同限制修饰系统三、Ⅱ型限制酶的特性-识别序列识别双链DNA分子中特定的4-8对核苷酸序列5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAG

3、CTC…5’EcoRI的识别序列EcoRI的切割位点5‘…GAGGCCGAG…3’3‘…CTCCGGCTC…5’HaeⅢ的识别序列HaeⅢ的切割位点大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧部分限制酶能识别多种核苷酸序列5‘…GCGTPyPuACGAG…3’3‘…CGCAPuPyTGCTC…5’HindⅡ的识别序列PydCMP、dTMPPudAMP、dGMP识别序列呈典型的旋转对称型回文结构5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的识别序列EcoRI的切割位点回文结构:两条核苷酸链的核酸序列呈双重旋转对称排列的D

4、NA双螺旋结构三、Ⅱ型限制酶的特性-切割后形成的末端粘性末端：5‘…GTGAATTCGA…3’3‘…CACTTAAGCT…5’EcoRI5‘…GTGAATTCGA…3’3‘…CACTTAAGCT…5’平齐末端：5‘…GAGGCCGAG…3’3‘…CTCCGGCTC…5’5‘…GAGGCCGAG…3’3‘…CTCCGGCTC…5’HaeⅢ彼此具有互补核苷酸的单链延伸末端三、Ⅱ型限制酶的特性-同尾酶、同裂酶同尾酶:来源各异、识别序列也不相同，但都产生相同粘性末端的一类限制酶5‘…GTGGATCCGA…3’3‘…CACCTAGGCT…5’BamHI5‘…G

5、TGGATCCGA…3’3‘…CACCTAGGCT…5’5‘…GTTGATCAGA…3’3‘…CAACTAGTCT…5’BclI5‘…GTTGATCAGA…3’3‘…CAACTAGTCT…5’BamHI、BclI为一组同尾酶同裂酶:来源各异，但识别相同核酸序列的一类酶5‘…GTGATCGA…3’3‘…CACTAGCT…5’Sau3AI5‘…GAGATCCA…3’3‘…CTCTAGGT…5’MboI5‘…GTCCCGGGGA…3’3‘…CAGGGCCCCT…5’XmaI5‘…GTCCCGGGGA…3’3‘…CAGGGCCCCT…5’SmaI四、影响限制

6、酶活性的因素DNA的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、EDTA、SDS增加限制酶用量扩大酶催化反应体系延长酶催化时间DNA的甲基化程度：反应温度：DNA的分子结构：酶缓冲液组成：甘油浓度：MgCl2：NaCl/KCl：Tris-HCl：β-巯基乙醇/二硫苏糖醇（DTT）：牛血清白蛋白（BSA）：第二节DNA连接酶DNA连接酶：能够催化双链DNA片段相邻的3‘羟基与5’磷酸基形成磷酸二酯键的酶作用特点只能连接双螺旋DNA分子，不能连接单链DNA分子；DNA链上必须具有游离的3’-OH和5‘-P；只能封闭DNA链上磷酸二酯键切口，不能封闭多个核酸分子缺失形成的裂

7、口；需要吸能：ATP/NAD+连接方式缺口DNA:平齐末端DNA：粘性末端DNA：5’5’3’3’OHP5’5’3’3’OHPPOH5’5’3’3’基因工程中常用的连接酶T4噬菌体DNA连接酶（T4连接酶）大肠杆菌DNA连接酶热稳定性DNA连接酶第三节DNA聚合酶DNA聚合酶：能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤的一类酶作用特点能够把脱氧核苷酸分子连续的加到DNA分子引物链的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用条件脱氧核苷酸原料：四种脱氧核苷三磷酸dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）引物链：带有3’-OH游离基团模板：单链或双链DNA

8、模板Mg2+：一、大肠杆菌DNA聚合酶Ι（DNApolI）酶特性：5’→3’聚合酶活性5’→3’核酸外切酶活