基因工程中常用的三种工具酶

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1、一、限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restrictionenzyme，RE）。2．类型：来自原核生物，有三种类型。Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相

2、同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、

3、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。三种限制酶的区别如下表所示：Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型DNA底物dsDNAdsDNAdsDNA辅助因子Mg2+,ATP,SAMMg2+Mg2+,ATP识别序列特异特异特异切割位点非

4、特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处）与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。另外用罗马数字代表同一菌株中不同限制酶的编号，现在常用来表示发现的先后次序。如HindⅢ是来自HaemophilusinfluenzaeD（嗜血流感杆菌D株第三种限制酶）。4．切割位

5、点和结果：限制酶位点在DNA链上是随机分布的，若识别位点为4bp，则44（256）个核苷酸可遇一个切点。若为6bp，则平均46（4096）个核苷酸才遇到一个切点。限制酶沿回文结构的对称轴切开，则产生平头末端（flushorbluntends）如BalⅠ。多数限制酶错位切开dsDNA，产生5′or3′-单链互补顺序，称为5′or3′-粘性末端（stickyorcohesiveends），如HindⅢ、PstI。5．反应条件：限制酶酶切反应的影响因素如下：（1）DNA的纯度限制酶消化DNA的反应效率，在很大程度上取决于所使用的D

6、NA本身的纯度。提取DNA时，蛋白质、RNA、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高盐等都有可能抑制限制酶的活性。小量制备的DNA尤其会遇到这种问题。RNA一般不影响酶的反应速度，但它能和蛋白质发生非特异性结合，从而减少酶的有效浓度。少量蛋白质污染不影响酶活性，但如果是Dnase污染则会导致DNA的降解，它可能来源于溶解DNA的试剂溶液或者酶解缓冲液的组分。由于Dnase的活性需要有Mg2+的存在，而在DNA的储存缓冲液中含有二价金属离子螯合剂EDTA，一般用1mmol/LEDTA溶液（TE）溶解DNA，在保存DNA的过程中因

7、为是低温，Dnase不会有活性，一旦将DNA加入反应体系，EDTA的浓度降低，在37℃温度下反应时，Dnase的活性就会发挥出来。混杂的结合蛋白则与DNA结合，不仅会封闭酶的识别序列影响酶解，而且形成的DNA—蛋白复合物将干扰DNA的电泳行为。要避免发生这种情况，唯一的办法就是使用高纯度的DNA。为了提高限制酶对低纯度DNA的反应效率，一般采用如下4种措施：①增加限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多。②增加酶反应体系的体积，以使潜在的抑制物被相应的稀释。③延长酶解反应的保温时间。④向反应体系中添加亚精胺（

8、spermidine）（终浓度为1~2.5mmol/L），亚精胺与负电性的杂质结合。注意，亚精胺在4℃时会沉淀DNA，因此最好在反应已经保温数分钟后再加入。DNA本身如果降解了，便无法挽救。但有时DNA纯度很好，不存在上面所述的问题，酶解效果不好就可能有两种原因，一是DNA没有溶解充分，加