基因工程中常用的工具酶

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1、二、基因工程的基本程序载体质粒外源DNA片段外源DNA插入剪切引入宿主细胞选出含有重组DNA的细胞扩增表达abbAAb第二章      基因工程中常用的工具酶第一节       限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割第二节DNA连接酶和DNA分子的体外连接第三节       其他工具酶第一节       限制性核酸内切酶与DNA分子的体切割限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。一、寄主控制的限制与修饰作用如图2-1，图2-2二

2、、限制性核酸内切酶的制备方法三、限制性核酸内切酶分类和命名四、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性五、影响限制性内切酶活性的因素分类：ⅠⅡⅢⅠ：识别和切割位点不固定，随机性。Ⅲ：核酸内切酶活性和甲基化活性是不分开的。Ⅱ：能在识别位点处切割DNA，切割位点固定。核酸内切酶活性和甲基化活性是分开的。常用。四、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性识别序列：1.4~7个核苷酸组成的特定核苷酸序列2.回文结构：两个顺序相同的拷贝在DNA链上呈反向排列。EcoRⅠ5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’经限制酶

3、切割后的位点,DNA断裂类型1.粘性末端(1)3’-OH单链延伸的粘性末端.如：PstⅠ5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’(2)5’-P单链延伸的粘性末端.如：EcoRⅠ5’-GAATTC-3’5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAG-5’2.平末端如:SmaⅠ5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’两种特殊的限制酶(1)同尾酶识别位点不同，酶切后产生同样的粘性末段的两种酶。如：BamHⅠ和BglⅡ(

4、2)同裂酶识别序列相同，对甲基化切点敏感性不同的两种酶。如:MboⅠ和Sau3AⅠ共同识别序列GATC，但对GmeATC切点,前者不能切，后者能切。五、影响限制性内切酶活性的因素1.DNA的纯度2.DNA的甲基化（1）基因工程使用失去甲基化酶的大肠杆菌（2）研究基因工程DNA的甲基化程度（3）改变限制酶的识别特性3.温度4.分子结构5.限制酶的缓冲液星号活性EcoRⅠ切GAATTCEcoRⅠ*切pupuATpypy或AATT第二节DNA连接酶和DNA分子的体外连接一、DNA连接酶DNA连接酶（L

5、igase）是一种能够催化在双股DNA链的3′-OH和5′-P之间形成磷酸二酯键的酶，可连接互补粘性末端或平端以及缺口修复，不能连接单链DNA或裂口.温度二、DNA分子的体外连接二、DNA分子的体外连接1．粘性末端DNA片段的连接和单切点的磷酸化2．平末端DNA片段的连接（1）T4DNA连接酶法（2）同聚物加尾法（3）用化学合成的衔接物连接DNA分子第三节       其他工具酶一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ二、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶）三、T4DNA聚合酶四、逆转录酶五、末端脱氧核苷酰

6、转移酶六、核酸酶S1七、核酸酶BAL31八、外切核酸酶Ⅲ九、T4多聚核苷酸激酶十、碱性磷酸酶十一、   甲基化酶命名HindⅢH:Haemophilus嗜血杆菌属in:influenzae流感d:Rd株Ⅲ：该菌株中第三个被分离到的限制酶同尾酶BamHI和BglIIAGATCTGGATCCTCTAGACCTAGGBglⅡBamHIAGATCCTCTAGGT4连接酶AGATCC（连接后的切点均不能被上述两种酶切）TCTAGG一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ1.三种活性（1）5’

7、-3’聚合酶活性（在有dNTP时）（2）3’外切酶活性（无dNTP时大亚基活性）（3）5’外切核酸酶活性（无dNTP时小亚基活性）2.在基因工程中的应用：缺口平移标记技术。二、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶）1.DNA聚合酶活性（切除小亚基，保留大亚基）2.3’外切酶活性（无dNTP时）3.在基因工程中的应用（1）标记粘性末端.-32P—dNTP标记平末端-32P—dNTP（2）将5’端伸出的末端填平（3）可用来反转录合成双链cDNA。（4）补平粘性末端。三、T4DNA聚合酶具有5’-

8、3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性。其外切酶活性比E.coliDNA聚合酶I的活性高200倍。取代反应四、逆转录酶逆转录酶可以RNA为模板，逆转录成cDNA第一链，又称依赖RNA的DNA聚合酶。1.聚合酶活性RNA或DNA为模板2.3’外切酶活性能使DNA-RNA杂合链中的RNA降解。应用：1.RT-PCR使mRNA逆转录成cDNA2.制备探针。五、末端脱氧核苷酰转移酶可催化DNA片段上的3’-OH端加接脱氧核糖核苷酸。常用于同种碱基多聚体接尾反应核素标记DNA片段的3’端六、核酸酶S1可以降