《基因工程工具酶》PPT课件

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1、基因工程工具酶生物与食品工程学院脱氧核糖核酸酶（DNase）特征：非特异性的随机水解双链或单链DNA的内切核酸酶。需要二价阳离子作为辅助因子作用方式与辅助因子相关外切核酸酶是一类能从DNA或RNA链的一端开始按顺序催化磷酸二酯键，产生单核苷酸的核酸酶。5’→3’3’→5’两端切割限制性内切核酸酶专一性地识别双链DNA上的特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开。生理功能：保护基因工程功能：剪刀甲基化酶功能：使核苷酸的碱基甲基化。甲基化酶同限制性内切核酸酶有完全相同的识别序列。可以用限制性内切核

2、酸酶的名称来命名甲基化酶。限制性内切核酸酶的命名生物属名的第一个字母生物种名的第一、二个字母菌株代号中的一个字母先后次序罗马数字限制性内切核酸酶的识别序列长度6二重互补对称回文结构可以通过电脑软件查找限制性内切核酸酶的识别序列限制性内切核酸酶切割特点黏性末端平末端同尾酶限制性内切酶的一些特点有些限制性内切核酸酶可以识别两种以上的核苷酸序列同裂酶不同的酶有相同的识别序列Star活性在特定的条件下，在不是识别序列处切割DNA限制性内切核酸酶的活性底物纯度分子构型侧面序列偏爱位点侧面序列对切割效率会有影响

3、甲基化限制性内切核酸酶反应系统酶的用量缓冲液反应温度http://www.takara.com.cn/（中文）http://www.invitrogen.com/site/us/en/home.htmlhttp://www.fermentas.com/cn/home限制性图谱DNA分子上限制性内切核酸酶识别序列的分布图。也称为物理图谱。当一种DNA分子的核苷酸序列被完全测定后，便可以绘出DNA分子上每种限制性内切核酸酶的限制性图谱。限制性图谱双酶切法1.用一系列限制性内切核酸酶分别切割目的DNA分子

4、。2.确定任一点为一种酶的切割位点。3.推断其它酶的切割位点。限制性图谱逐步切割DNA片段法核酸外切酶电泳条带前移推算DNA连接酶催化DNA分子链的相邻3’羟基与5’磷酸基团形成磷酸二酯键。分为1.依赖ATP2.依赖NAD+DNA连接酶E.coliDNA连接酶催化双链DNA片段互补黏性末端的连接，不能催化平末端链接。最适反应温度30℃，但为了提高氢键的稳定性，实际反应温度控制在4~15℃，适当延长反应时间。DNA连接酶T4DNA连接酶既可以连接黏性末端的连接，也可以用于平末端的连接。依赖于ATP，反

5、应温度控制在4~15℃,平末端需要在较高的温度下进行。DNA片段的连接方法互补黏性末端平末端黏性末端修饰成平末端平末端修饰成互补的黏性末端加连杆或衔接头逆转录酶依赖RNA的DNA合成酶用于体外cDNA的合成构建cDNA文库，从中筛选特异的目的基因。末端脱氧核苷酸转移酶功能：将脱氧核苷酸分子一个一个的加到DNA片段的3’羟基上，不依赖于模板，dNTP中的任何一种都可以作为反应的前体利用此性质，可以给平末端DNA片段的3’羟基加上同聚物。碱性磷酸酯酶功能：催化核酸分子脱掉5’磷酸基。避免在DNA重组时的

6、自我连接。DNA聚合酶功能：催化以DNA单链为模板，4种脱氧核糖核苷酸为底物，合成与模板链互补的DNA新链。5’-3’方向的聚合酶活性3’-5’外切核酸酶活性RNA聚合酶依赖DNA的RNA聚合酶这些RNA聚合酶只能转录含有它们各自特异启动子序列的DNA，转录出相应的RNA。溶菌酶功能：水解细菌细胞壁肽聚糖支架。以鸡蛋清中含量最多3.4~3.5%蛋白酶K高活性，非特异性的蛋白水解酶，在很宽的PH范围内（4~12.5）有活性，最适PH为7.5~12对热稳定。纤维素酶将纤维素水解成纤维二糖和葡萄糖的一组酶

7、作业：1.限制性内切核酸酶和DNA连接酶的催化功能2.限制性内切核酸酶切割DNA后可能会出现什么样的DNA片段末端3.DNA连接酶有那些连接方法ThankYou