基因工程-2章 基因工程工具酶

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1、2021/8/81第二章基因工程工具酶一、基因工程工具酶的概念二、限制性内切核酸酶三、其他基因工程工具酶一、基因工程工具酶的概念基因工程工具酶的概念是应用于基因工程的各种酶的总称，包括核酸序列分析、标记探针、载体构建、目的基因选取、重组体DNA制备等程序中所需要的酶类。核酸酶：能够将聚核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶，属于水解酶，作用于磷酸二酯键的P-O位置。2021/8/82根据核酸底物：分为DNA酶、RNA酶。根据对底物作用方式：分为核酸内切酶和核酸外切酶。核酸内切酶：指能从核酸分子内部切割磷酸二酯键。核酸外切酶：指能从核酸分子末端开始一个一个切割下核苷酸的酶。5

2、核酸外切酶：从端切除核苷酸的核酸外切酶。5核酸外切酶：从5端切除核苷酸的核酸外切酶。2021/8/832021/8/84基因工程中常用的工具酶二、限制性内切核酸酶(一)寄主细胞的限制与修饰现象限制(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主复制受到限制。限制作用:实际就是限制性内切核酸酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。2021/8/86修饰(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰,从而免遭自身限制性酶的破坏。修饰作用

3、:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。2021/8/87(二)限制性内切核酸酶(restrictionednonuclease)1.限制性内切核酸酶的概念内切核酸酶：是指将核酸内部的二酯键切断的核酸酶。限制性内切核酸酶：是指能够识别双链DNA分子上某个特定的碱基序列并且将其切断的一类核酸酶。2006年2月共发现3773种限制性内切酶，I、II、III型各有68、3692、10种，甲基化指导的3种,商品化的609种,II型中共有223种特异性。2021/8/882.限制性核酸内切酶的分类根据限制性内切核酸酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶

4、活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三类。2021/8/893.Ⅱ型限制性核酸内切酶的功能Ⅱ型限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序,它以核酸内切方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5′端为P，3′端为OH，识别序列一般为4～6个碱基对,通常是具有180°的旋转对称性的回文结构。Ⅱ型限制性核酸内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口。2021/8/8102021/8/811动画2021/8/8122021/8/8134.II型限制性核酸内切酶酶切反应操作⑴大部分Ⅱ型限制性内切核酸酶反应条件：Tris-HCl50mmol/LpH7.5MgCl210mmol/LNaCl0-10

5、0mmol/LDTT1mmol/LVolume20-100μLTemperature37℃Time1-1.5h◆1个单位限制性核酸内切酶：在建议使用的缓冲液及温度下，在20μL反应液中反应1h，使1μg标准DNA完全消化所需的酶量。2021/8/814⑵Ⅱ限制性核酸内切酶操作的注意事项①反应体系中酶体积不能超过总体积的10%：商品化的限制性内切核酸酶均为浓缩液,每次操作时应使用新的吸头去取酶，加入酶的体积应不超过总体积的10%，否则酶液中的甘油浓度超过5%时将会抑制酶的活性。2021/8/816②整个操作应在0℃进行。即在冰浴中进行,而且是在加入其它试剂之后,最后加入酶。

6、③大量切割DNA时,采用延长反应时间,减少酶的用量。④2种以上酶切DNA时,选通用缓冲液。若没有通用缓冲液时,只有用1种酶切完后,纯化酶切产物,再进行下一个酶切反应。2021/8/8175.影响限制性内切核酸酶活性的因素①DNA的纯度DNA样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等,都有可能抑制酶活性。可采用以下方法，提高酶活性：加大酶的用量，1μgDNA用10U酶加大反应总体积延长反应时间2021/8/818②DNA的甲基化程度大肠杆菌中的dam甲基化酶在5′GATC3′序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有BclIMbol等，但BamHI、B

7、glII、Sau3AI不受影响。大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5′CCAGG3′或5′CCTGG3′序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等，但BglI、KpnI不受影响。采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA，可防止DNA的甲基化。2021/8/819③酶切消化反应的温度多数标准反应温度是37℃,如SmaI为25℃或30℃，SfiI为50℃。反应温度过度或过低都会影响酶活性，甚至导致酶失活。④DNA的分子结构某些酶切割超螺旋质粒DNA时，酶量比切割线性DNA时高出多倍，可高达20倍。2021/8/82