何水林版基因工程 第三章分子克隆载体.ppt

《何水林版基因工程 第三章分子克隆载体.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第三章 分子克隆载体（Molecularcloningvectors）周毅峰2013春在基因工程中，通常是把外源DNA片断利用运载工具送入生物细胞。携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫做载体(Vector)。载体(Vector)载体的本质是DNA。经过人工构建的载体，不但能与外源基因相连接，导入受体细胞，还能利用本身的调控系统，使外源基因在新细胞中复制以致功能的表达。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆

2、载体基因工程中常用的主要载体质粒(Plasmid)，主要指人工构建的质粒噬菌体载体柯斯质粒(cosmid)单链DNA噬菌体M13动物病毒人工染色体(artificialchromosome)2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体载体的功能及特征载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转

3、移性）具有合适的筛选标记具有较高的外源DNA的载装能力具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体pBR3224363bp2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体克隆载体（cloningvector）对目的基因克隆，建立DNA文库和cDNA文库，其上有复制子即可按功能分类表达载体（expressionvector）使目的基因在宿主细胞中表达，既有复制子，又有强启动子穿

4、梭载体（shuttlevector）可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体第一节质粒（Plasmid）质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNA，一般大小约106~108D，可自身复制和表达。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体基因克隆载体的质粒DNA分子，必定包括：复制基因、选择性记、克隆位点。2012年3月基因

5、工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体1质粒的基本特性2质粒DNA的分离纯化4重要的大肠杆菌质粒载体3质粒载体的构建及类型2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体1.1质粒DNA的构型两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构，称为共价闭合环形DNA（cccDNA），通常呈现超螺旋的SC构型只有一条DNA链出现有一至数个缺口，称为开环DNA（ocDNA），此即OC构型线性分子DNA（IDNA），称为L构型1质粒的基本特性2012年3月基因工程中－GeneEngin

6、eering第三章分子克隆载体2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体1.2质粒DNA分子大小质粒宿主分子大小/kbpPbs蓝藻1.5ColE1大肠杆菌6.4ColV2大肠杆菌140Ti致癌农杆菌330左右PV21三叶草根瘤菌700F大肠杆菌942012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体1.3质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）的多少，

7、质粒可分为两大复制类型：严紧型质粒（stringentplasmid）在宿主细胞中拷贝数少的质粒，1－数个拷贝松弛型质粒（relaxedplasmid）在宿主细胞中拷贝数多的质粒，10个拷贝以上2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体低或单拷贝质粒的复制必需由复制子本身编码一个必不可少的顺式作用蛋白(repA)来对复制起点作正调控作用，如psc101等，同时其复制受宿主蛋白合成的影响。所以这些质粒的拷贝数不能通过诸如氯霉素等蛋白质合成抑制剂来增加拷贝数1）松弛复制型多拷贝质粒

8、（pMB1或ColE1等）的复制不受宿主菌蛋白合成的影响的影响；当蛋白质合成不能进行时，复制依然进行2)严紧型复制2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体Howmanycopiescanbereplicated?2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体NegativecontrolpositivecontrolanswersRepr