基因工程第三章克隆载体

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1、第二节病毒载体virusvector什么是病毒?病毒：由DNA（或RNA）和外壳蛋白组成，经包装后成为病毒颗粒。1/311噬菌体的溶原性周期和溶菌性周期天然的转基因过程2/3121.λ噬菌体克隆载体λ噬菌体（Bacteriophagelambda）头部尾部尾丝3/313（1）λDNA：线状，双链DNA，48502bp（linear，double-strandedDNA，dsDNA）cos位点：λDNA两端各有12bp的粘性末端，两者互补，进入宿主后可连成环状DNA。1.1、λ噬菌体的性质4/314宿主细胞头部尾部尾丝λDNA5/3156/316（2

2、）λDNA有56个限制酶识别序列，50个基因，左臂，右臂和中央片段，中央片段可以被替代。Cos头部合成尾部合成删除与结合重组DNA合成晚期控制阻遏阻遏早期控制溶菌成熟左臂leftarm右臂rightarm中央片段centralstuffer7/317(3)、λ噬菌体的侵染8/3181.2、λ噬菌体载体的构建（1）切去λDNA的中央片段BamHIsitesLeftarmRightarmCOSCOSBamHICOSCOSLRCOSCOSLR回收9/319（2）插入标记基因（markergene）例如：lacZ基因，转化的菌斑在含有X-gal的培养基因上

3、表现篮色.10/3110（3）插入外源基因（foreigngene）可插入20kb的目的基因。11/3111部分消化DNAligase基因组DNACOSCOSLRAimgeneLRAimgeneCOS12/3120kb的DNA片段12（4）建立λDNA体外包装系统（packingsystem）包装后方可侵染.13/3113重组的噬菌体体外包装14/31142、柯斯质粒载体（Cosmidvector）2.1含义：含有λ噬菌体粘性末端（cos位点）的质粒，又称粘粒2.2特点：带有cos位点4-6kb有标记基因常用于构建cDNA文库（cDNAlibrar

4、y）可携带大的基因片段，45kb。2.3构建过程15/3115体外包装16/3116第三节、染色体定位整合载体基因整合平台系统：包括整合平台和定位整合克隆载体。整合平台：受体细胞基因组上给定的一个DNA区域，是外源DNA定位整合的位置。定位整合克隆载体：质粒克隆载体，有一个或两个与整合平台DNA区域同源的DNA片段。17/3117一、定位整合模式ForeignDNAHomologoussequenceVectorDNAGenomeDNAofreceptorcellGenomeDNAofreceptorcellHomologoussequenceVe

5、ctorDNA18/3118与受体细胞和同源序列长短有关，一般较低(10-7-10-3).会出现随机插入，筛选困难。二、定位整合效率19/31191定义酵母人工染色体：具有酵母染色体的着丝粒（cen4）、自主复制序列(ARS1)和端粒等功能序列的质粒载体。可容纳1000至3000kb的DNA大片段。第四节YAC克隆载体20/3120是Yeast和E.coli.的穿梭载体(shuttlevector)YAC在E.coli.中按质粒形式复制，转入酵母菌后按染色体形式复制。穿梭载体:含有不止一个复制起始位点、能携带插入序列在不同种类宿主细胞中繁殖的载体2

6、1/3121着丝粒端粒自主复制序列22/31端粒E.coli.originofreplicationmarkergenesinyeastmarkergenesInE.coli.markergenesinyeast22外源基因EcoRI23/31YAC克隆载体的构建232应用2.1构建基因组文库（genomelibrary）：特别适于动植物等基因组较大的生物。2.2、基因治疗(Genetherapy)：可复制，安全24/3124一、启动子探针型载体质粒载体，含有一个检测部件（一个无转录功能的标记基因和克隆位点）第五节、特殊用途的载体25/3125Th

7、egenewhichcannotexpressGFPgeneMultiplecloningsitesAMPr26/3126二、诱导型表达载体：启动子在特殊的诱导条件下才有转录活性。外源基因处于这样的启动子下，必须有诱导条件才能表达。优点：易于人的控制，安全，可用于基因治疗。27/3127三、组织特异性表达载体只能在特定组织中表达的载体。乳腺组织特异性表达载体：利用牛、羊等动物的乳腺产生药物。肿瘤细胞特异性表达载体：基因治疗药物的定向导入。28/3128四、分泌型表达载体基因表达的蛋白可分泌到胞外，利于产物分离纯化。29/3129本章主要内容小结：常

8、用质粒载体、Ti质粒载体。病毒载体染色体定位整合载体酵母人工染色体载体特殊用途的克隆载体上述载体的结构特点及构建方法及原理