基因工程-第三章-基因工程的载体

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1、第三章基因工程的载体载体：携带外源基因进入受体细胞的工具用于基因工程的载体细菌质粒载体噬菌体λ衍生载体Cosmid载体Phagemid载体酵母质粒载体真核病毒载体Bacmid载体YAC载体6/15/2021苏州科技学院生物系叶亚新发展概况1.第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322(1977,Bolivaretal)2.第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。3.第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不

2、同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。6/15/2021苏州科技学院生物系叶亚新第三章基因工程的载体作为基因工程载体的基本功能1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供条件6/15/2021苏州科技学院生物系叶亚新第三章基因工程的载体作为基因工程载体必须具备的基本条件1.具有对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3.长度尽可能小，以提高其载装能力4.具有多种单一的酶切位点5.具有合适的选

3、择性标记6/15/2021苏州科技学院生物系叶亚新遗传标记基因1.标记基因的作用1）指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞这种指示可以是选择性的（Apr，Tcr，Kanr），也可以是非选择性的（如lacZ）2）指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。*这种指示也可以是选择性的（如TcS），也可以是非选择性的（如TcS，lacZα,GUS），绝大多数为后者。**有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第一作用时，最好是选择性标记基因；当完成第二作用时，目前多采用非选择性的—检测性标记基因。有的基因是不能用作选择性标记

4、基因（lacZ，GUS等）。6/15/2021苏州科技学院生物系叶亚新2.标记基因的种类1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子）a.抗生素抗性基因:Apr，Tcr，Cmr，Kanr，G418r，Hygr，Neorb.重金属抗性基因:Cur，Znr，Cdrc.代谢抗性基因:TK，抗除草剂基因2）营养标记基因（可直接用于选择转化子）主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因，这类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。3）生化标记基因其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ,GUS,CAT4）

5、噬菌斑6/15/2021苏州科技学院生物系叶亚新3.使用标记基因注意要点1）标记基因与宿主细胞2）标记基因产物的作用机制:Apr3）标记基因的结构与适用范围:基因启动子,翻译起始序列,密码子偏爱性4）标记基因的结构变化对功能的影响:LacZ,GUS4.常用的遗传标记基因1)四环素抗性基因（Tcr）Tetracycline可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一种399AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。6/15/2021苏州科技学院生物系叶亚新2)氨苄青霉素抗性基因（A

6、pr）Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化β—内酰胺环的水解，使氨苄青霉素失活。3)氯霉素抗性基因（Cmr）Chlorophenicol可结合在核糖体50S亚基上，阻止蛋白质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。4)卡那霉素(Kanr),新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。来自转座

7、子Tn5和Tn903的Kanr抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。6/15/2021苏州科技学院生物系叶亚新5）β—半乳糖苷酶基因（lacZ和lacZα）β—半乳糖苷酶基因有1021AAs，基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个部分可独立存在，分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之为lacZα(编码145AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为标记基因。β—

8、半乳糖苷酶基因的优点:a.酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观b.lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性c.lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大6/