第三章 基因工程载体

《第三章 基因工程载体》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、第三章基因工程载体基因克隆载体要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工具就是运载体。基因克隆载体(DNA克隆载体)：通过不同途径能将承载的外源DNA片段(基因)带入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子。载体的功能及特征一、发展概况1.第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322(1977,Bolivaretal)2.第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。3.第三阶段：进一步完善载体功能以满足

2、基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件载体应具备的条件在克隆载体DNA分子合适的位置有一至多个克隆位点，供外源DNA片段组入克隆载体DNA分子。至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。克隆载体必须是安全的。第一节质粒克隆载体一、质粒的一般生物学特性发现：细菌，偶见于链霉菌和酵母独立于染色体之外进行复制和遗传,又依赖于宿主编码的酶和蛋白质来

3、进行复制和转录。比病毒还简单的亚细胞结构，一旦离开寄主细胞则无法繁殖。一、质粒的一般生物学特性质粒是细菌染色体外能够自主复制的环形双链的DNA分子在宿主细胞内，质粒一般以超螺旋共价闭合环DNA分子（ccc-DNA）的形式存在。在体外理化因子作用下，质粒可以成为开环DNA分子（oc-DNA）或线形DNA分子（l-DNA）。在变性条件下，质粒可成为单链DNA分子（ss-DNA）。质粒DNA分子大小1-100Kb以上。质粒DNA的复制质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制复制方向性：纯单向性（ColEI）；纯双向性（F质粒）；既有单向又有双向性（R6K）。根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多

4、寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒1–数个拷贝stringentplasmid松弛型复制控制的质粒10个拷贝以上stringentplasmid质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制–质粒DNA复制启动控制控制复制引物与模板的结合oriE.coliColE1plasmid复制方向rop（+）RopRNAIIRNAI3’5’5’3’质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制–质粒DNA复制启动控制控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合PcopcopP/OrepreporiCopRep质粒的不亲和性有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个

5、寄主细胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖构成中，其中必然有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒。以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容质粒迁移革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用如Col、R的其它成员值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过

6、程由bom和mob基因决定携带特殊的遗传标记野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义质粒载体二、构建质粒克隆载体的基本策略1、能在转化的受体细胞中进行有效的复制，并有较多的拷贝。2、含有尽可能多的克隆位点。3、含有供选择克隆子的标记基因。4、构建的质粒克隆载体DNA分子尽可能小。5、根据特殊需要，使构建的质粒克隆载体中组装各种“元件”（小DNA片断），构建成不同用途的质粒克隆载体。三、质粒克隆载体的构建质粒克隆

7、载体的设计和构建过程的原则选择合适的出发质粒（亲本质粒）。正确获得构建质粒克隆载体的元件。组装合适的选择标记基因。选用合适的启动子。在能达到预期目的的前提下，构建质粒克隆载体的构建过程力求简单。大肠杆菌质粒克隆载体pBR322及其衍生质粒克隆载体的构建pBR322的构建是质粒载体构建的一个典范。pBR322的亲本质粒pSF2124，含有Amp抗性基因pMB1，含有松弛型ColE1的复制起点（ori