05—基因工程载体第三章

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1、第三章基因工程载体第一节基因克隆技术概述一、基因克隆技术基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组的DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。二、目的基因的取得1、直接2、反转录酶3、化学合成4、基因文库5、PCR首先利物理方法（如剪切力、超声波等）或酶化学方法（如限制性内切核酸酶）将生物细胞染色体DNA切割成为基因水平的许多片段，继而将这些片段与适当的载体结合。将重组DNA转入受体菌扩增，获得无性繁殖的基因文库，再结合筛选方法，从众多的转化子菌株中选出含有

2、某一基因的菌株，从中将重组的DNA分离、回收。这种方法也就是应用基因工程技术术分离目的基因，其特点是绕过直接分离基因的难关，在基因组DNA文库中筛选出目的基因。可以说这是利用“溜散弹射击”原理去“命中”某个基因。由于目的基因在整个基因组太小，在像当程度上还得靠“碰运气”，所以人们称这个方法为“鸟枪法”或“散弹枪”实验法。面包酵母吲哚甘油磷酸脱氢酶基因的制取，先用EcoRI把面包酵母DNA切成许多片段，使这些片段与λ载体连成重组DNA，可把这些重组DNA导入“吲哚甘油磷酸脱氢酶型组氨酸缺陷型”大肠杆菌，在基本培养基中培养。只有引入了该基因的细

3、菌才能生长。进一步分离这种菌株，可以得到目的基因。三、重组体的构建1、载体要把一个有用的基因通过基因工程手段送进生物细胞中，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫载体（Vector）。（1）质粒（plasmid)（2）噬菌体的衍生物（3）科斯质粒（cosmid）（4）单链DNA噬菌体M13（5）病毒2、载体的性质1）它必须具有能够在某些宿主细胞中独立地自我复制和表达的能力。2）载体DNA的分子量应该较小。3）载体上最好应具有两个以上的容易检测的遗传标记（如抗药性基因等），以赋予宿主细胞以不同的表型。4）载体应该具有多个限制性内

4、切酶的单一切点；载体上的单一酶切位点最好是位于检测表型的遗传标记基因之内，这样目的基因是否已连接载体就可以通过这一表型的改变与否而得知，利于筛选重组体。3、酶系的选用四、转化及重组子筛选鉴定1、转化（transformation)获得重组DNA以后，必须将它导入宿主细胞中以扩增表达，这个导入宿主细胞的过程称为转化（transformation）感受态（competence)、电击2、重组子3、重组子的筛选方法（1）载体上的报告基因（reportergene)抗药性基因、lacZ基因的显色反应、发光基因（lux)（2）单菌落扩增（3）菌落杂交

5、第二节质粒载体（PlasmidVector)一、质粒的概念附加体（整合质粒，intergrativeplasmid)二、质粒的一般生物学特性1、质粒DNA（1）SC构型：共价闭合环形DNA(closedcircleDNA,ccDNA)（2）OC构型开环DNA(opencircleDNA,ocDNA)（3）L型线性DNA(linkerDNA,lDNA)质粒名称质粒来源核苷酸长度（kb）分子量(MD)pTiAch5土壤农杆菌213142ToL假单胞菌11778F大肠杆菌9563RP4假单胞菌5436ColE1大肠杆菌6.364.2pBR322

6、大肠杆菌4.3622.9pBR345大肠杆菌0.70.462、质粒的复制与遗传根据质粒与宿主菌的相关程度某种质粒在一个细菌细胞内的数目就称为这种质粒的拷贝数（copynumber）严密型质粒（stringentplasmid)松弛型质粒(relaxedplasmid)根据质粒是否带有转移基因（tra基因）接合型质粒（传递性质粒）非接合型质粒严密型质粒（stringentplasmid)严密型质粒通常是一些具有自身传递能力的大质粒，复制与宿主菌密切相关，宿主菌内只有1-2个质粒拷贝存在，当宿主菌蛋白合成停止时，质粒的DNA复制也就随之停止松弛

7、型质粒(relaxedplasmid)松弛型质粒通常是分子量较小，不具传递能力的质粒，它在宿主菌内通常可含10-200个拷贝，而且不受宿主菌蛋白合成的影响，当宿主菌蛋白质合成停止时，例如当宿主菌遇上有抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素或壮观霉素存在时，质粒DNA的复制仍可继续进行，甚至可将数十个增至几千个。接合型质粒又叫传递性质粒，接合型质粒可以从一个细胞自主地转移到原来不存在这种质粒的另一个细胞中去。接合型质粒的分子比较大，编码一套控制质粒DNA转移的基因。这一过程是由接合型质粒上的转移基因（tragenes）控制的。非接合型质粒

8、，由于分子小，不足以编码全部转移体系所需要的基因，因而不能够自我转移。所谓质粒的不亲和性，有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一