基因工程周岩基因工程载体

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1、第四章基因工程载体作为一个理想的载体，应具备以下条件：载体：这种能与目的基因结合，且有完整的复制和转录功能的DNA大分子称之为载体（vector）。（1）能够在宿主细胞中存在并繁殖，有功能良好的复制子和启动子，使插入基因复制和表达；（2）具有多种限制性内切酶的切点，且切点是单一的，这样可将多个外源DNA片段插入其中；（3）具有容易检测的筛选标记；（4）载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段，又可在受体细胞内扩增较多的拷贝；（5）在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传代而不易丢失。第一节微生物基因工程载体克隆载体（clonevector）：主要是对目的基因克隆，建立D

2、NA文库和cDNA文库，其上有复制子即可；表达载体（expressionvector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要有强启动子；穿梭载体（shottlevector）：这类载体可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。一、质粒载体1.严紧型和松驰型质粒严紧型质粒：在宿主细胞中的拷贝数较少，一般只有1～3个。松驰型质粒：其拷贝数较多，一般20～60个，多的可达200～300个。2、转移型和非转移型质粒转移型，结合型（conjugativeplasmid）：是指一些质粒在不同的菌株中可以相互转移。非转移型质粒(non-conjugativepl

3、asmid)：则只能在一种寄主中生存。3.质粒的不相容性和不亲和群质粒的不相容性：一般地，不同质粒不能共处在一个细胞中，这种特性称质粒的不相容性，当它们处在一起时，便有生存竞争，结果一种质粒繁殖，另一种逐渐被排斥，数目变少。不亲和群：彼此不相容的质粒组成一个不亲合群。（二）质粒的命名1.人工组建的质粒人工组建的质粒的第一个字母是质粒英文名字（plasmid）的第一个字符p，用小写。p后有2个字母是大写，表示质粒的作者和实验室名称，再其后为质粒的编号。例：pXYp109；pSC101等天然载体质粒的第一个字母大写，且质粒符号用括号括起来。如（ColE1）；农杆菌质粒用p加Ti（Tume

4、rinducing）或At（Agrobacteriumtumefacions）表示，如pTiC58。2.天然载体质粒（三）常用质粒载体1.pSC101图2.pBR322（1）组成它由三部分组成：来自pSCl01的四环素抗性基因Tetr来自ColEl的衍生物pMBl的松弛复制起点ori来自RSF2124的氨苄青霉素抗性基因Ampr。（2）特点具有多个单一的限制性内切酶位点。Tetr中有BamH1切点（G↓GATCC）和SalⅠ切点（G↓AATTC），Ampr中有PstⅠ切点（CTGCA↓G）。利用ColEl的复制子，所以在细胞中是多拷贝的，可通过氯霉素使质粒拷贝数进一步扩增。（3）重组

5、克隆的“插入失活”筛选方法pBR322—→外源基因插入在Tetr中，基因型为Tets、Ampr——→在含有氨卞青霉素培养基上可生长，在含有四环素培养基上不生长；pBR322—→外源基因插入在Ampr中，基因型为Tetr、Amps、——→在含有氨卞青霉素培养基上不生长，在在含有四环素培养基可生长；而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。这种在一个基因位点中插入外源DNA片段，从而使该基因活性丧失的现象叫插入失活。AmprTetrTetrAmpsPstI........涂布有Tet的培养基涂布有Amp的培养基......重组体的筛选外源基因的插入：.3、pUC系列质粒载体（1）特点具有

6、更小的分子量（2686bp）和更高的拷贝数。具有多克隆位点可用组化方法鉴别：可通过插入失活法进行筛选含有一个来自于大肠杆菌的经过加工的LacZ基因（LacZ′），它编码β-半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸，可以和β-半乳糖苷酶缺陷型的大肠杆菌实现基因内互补，即α—互补，恢复分解乳糖的能力。X-gal也是β-半乳糖苷酶的一种底物，经降解后可生成溴氯吲哚，使大肠杆菌菌落呈蓝色。当无β-半乳糖苷酶时，X-gal不被分解，菌落呈白色。当外源基因插入到pUC质粒的LacZ′基因内部，则LacZ′基因受到破坏，便不能再和缺陷型受体菌中生成有活性的β-半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色。反之，非重组体为蓝

7、色菌落。含Ampr抗性基因，可通过插入失活和颜色反应进行双重筛选。lacZ’lacZ’N端C端缺陷型大肠杆菌完整的β-半乳糖苷酶（四）大肠杆菌中的表达载体表达载体应含有：（1）强启动子（2）在启动子下游区和ATG上游区有一个好的SD序列。（3）在外源基因插入序列下游区要有一个强的转录终止序列，保证外源基因有效转录和质粒的稳定性。二、噬菌体载体（一）λ噬菌体载体1、λ噬菌体载体的特征λ噬菌体颗粒中DNA为线状双链DNA分子，全长48502bp，两端各有一段长