基因工程-载体.ppt

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1、第三章基因工程载体生物科学与技术学院基因工程载体的概念把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫载体。作为基因工程载体，质粒至少应该具备复制的起始区、选择标记基因区、多克隆位点等部分。复制的起始区：能在宿主细胞内进行独立和稳定的自我复制。选择标记基因区：可以筛选重组体。多克隆位点：方便外源基因的插入。第一节质粒载体质粒（plasmid）：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。广泛存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞

2、中。质粒染色体质粒的一般生物学特性：分子大小差异大：1—200kb编码基因少：2—3个中等大小的蛋白质。如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的特性（非必须）。形状：双链环状DNA；线性双链DNA；超螺旋等。质粒的空间构型：质粒空间构型与电泳速率：同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同，scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。共价闭合环状DNA（CovalentclosecircularDNA，cccDNA)，呈超螺旋（SC）（supercoil）开环DNA（opencircular，ocDNA），一条链上有一至数个缺口

3、线形DNA（linear，lDNA）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可以分为：1、接合型质粒（能自我转移）：除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。如：F质粒（性质粒、或F因子）。甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。不符合基因工程的安全要求。2、非接合型质粒（不能自我转移）：虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。如R质粒（抗生素抗性质粒）和Col质粒（大肠杆菌素colicin）。符合基因工程的安全要

4、求。大肠杆菌素是大肠杆菌分泌的一类细菌素（bacteriocin），对于其他不能分泌特异性大肠杆菌素免疫蛋白（Immunityprotein）的细菌具有杀灭作用，现在一般认为有调节菌群数量的作用。大部分大肠杆菌素由质粒编码，其中最著名的没过于pColE1。质粒的复制类型严紧型质粒（stringentplasmid）：拷贝数少，只有1—3份拷贝。（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）。松弛型质粒（relaxedplasmid）：拷贝数多，有10—60份拷贝。（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。质粒的不相容性又称质粒的不亲和性，在没有选择压力

5、的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定共存，这一现象称为质粒的不相容性,又称质粒的不亲和性。质粒的复制过程质粒的复制主要是通过θ型复制和滚环复制两种方式之一进行的，其中以θ型复制为主。在θ型复制中，有单向半保留复制和双向半保留复制。Ori复制起点θ型复制滚环复制在革兰氏阳性细菌中大多数质粒是以滚环方式复制。复制起点(ori)区的功能复制起点是一段特定的DNA序列，长约几百碱基对，在其相关的调控元件中含有由质粒或宿主染色体编码的、参与DNA合成起始调控因子的结合位点。在大多数质粒中，与复制有关的蛋白质基因位于or

6、i序列附近，因此ori位点周围的小范围DNA是质粒复制所必需的。如果质粒DNA的大部分区域被去掉，而只保留质粒的ori序列，而且质粒是环状的，则质粒仍然能进行复制。将ori区克隆到一个不能自主复制的环状双链DNA分子上并引入到原核细胞后，该重组DNA具有自主复制能力。分子克隆中常用的质粒载体就是以这种方法构建的，同时用这种方法可以确定哪部分DNA是ori区并研究ori区的功能。ori区域常决定了质粒的许多特性，如质粒的寄主范围和质粒的拷贝数。质粒的命名用小写字母p代表质粒（plasmid），在p字母后用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实

7、验室名称，再加上质粒编号。如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F.Bolivar和R.L.Rodriguez，322为编号。质粒载体的构建天然质粒的局限性1、分子量大，拷贝数低，第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长9.1kb。但只有一个EcoRI切点充当克隆位点，Tetr作为筛选标志。EColRI酶切位点位于Tetr基因外部，外源基因插入不会引起筛选基因失活，因此无法区别重组体和野生型质粒。2、天然质粒ColE1质粒，长度为6.3kb，唯一的EcoRI酶切位点位于筛选标志基因大肠杆菌素E

8、1（colicinE1）内部。colicinE1能杀死不含ColE1质粒的菌，形成“噬菌斑”。可以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗colicinE1的细胞。质粒载体的