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1、基因工程载体南京农业大学陈溥言概述基因工程是利用酶学方法将不同来源的DNA或cDNA，在体外切割、修饰、连接插入到不同目的的基因工程载体中，进行扩增和表达，研究基因结构和功能，基因和蛋白质关系的一种分子生物学技术。载体基因工程的十分重要的工具。载体DNA分子中是有一段生长扩增的非必需区，该区经人工改造后可插入外源的DNA，并可送入宿主细胞中，使外源DNA与载体DNA重组并共同扩增。目前的载体主要有：1,质粒（Plasmid）载体2,入噬菌体3,柯斯质粒（Cosmid）4,M13噬菌体5,杂交质粒6,病毒载体，包括穿梭载体（Shuttle）。7,细菌人工染
2、色体.(bacterialartificialchromosome，Shizuya，1992BAC)8,酵母人工染色体(yeastartificialchromosome，Merry，1983YAC)9,来源于P1的细菌人工染色体（P1-derivedartificialchromosomePAC,loannon，1994）、10,哺乳动物人工染色体（MAC，mamalartificialchromosome，Farr，1991）11,人类人工染色体（HAC，humanartificialchromosome，Harrington,1997）12,植物人
3、工染色体(PAC)质粒载体（Plasmid）一词最早是由Lederberg，1952年提出的。是双链、闭环DNA复制子（replicon）,存在于细菌的细胞质中并独立于染色体之外,能自主复制的一类DNA。酵母的杀伤质粒（KillerPlasmid）是例外,它是一种RNA复制子。根据导链霉菌中存在线状质粒。质粒是细菌复制所非必须的，也就是说细菌失去质粒后仍可正常生长繁殖。但质粒可以赋于寄主某种新的有利的表型。质粒载体质粒DNA的一般特点：①质粒DNA可在宿主菌中自主复制，又是细菌复制非必须的。②占总的基因组的1～3%。③所有原核生物都有质粒。④赋于细菌一种
4、表型，是菌株特性不是菌种特性。⑤隐蔽质粒(Crypticplasmid)。⑥质粒都是双链闭环DNA复制子，酵母的杀伤质粒例外(RNA)。质粒的一般生物学性质1969年Rownd提出严紧型复制控制的质粒和松驰型控制的质粒。主要指在标准的培养基生长条件下，每个细菌中所含的质粒DNA的拷贝数多少划分的。严紧型质粒，一般分子量较高；每个寄主细胞中仅含10~60个拷贝的质粒；松驰型质粒,每个细菌中所含的质粒DNA的拷贝数高,一种质粒究竟属于严紧型还是松驰型并不是绝对的。往往与寄主状况有关。质粒的复制不仅受自身的制约，而且还受寄主菌的控制。氯霉素是蛋白质合成的抑制剂
5、，一般在细菌生长的对数生长期后期(细菌达1×109细胞/mL)，加入氯霉素或壮观霉素，细菌染色体和严紧型质粒复制停止，而松驰型质粒经过10~12小时，每个细胞中可多达几百个，甚至几千个质粒。每个细胞中可达50%以上DNA是质粒DNA。严紧型(Stringentplasmid)和松驰型(relaxedplasmid)质粒PUC质粒都属松驰型质粒。PACYC184等质粒属严紧型质粒。根据需要使用严紧型还是松驰型质粒,如果插入外源DNA较大,或其产量过高会产生对宿主菌新陈代谢有干扰作用时，常选用严紧型质粒。反之选用松驰型质粒。2.质粒的不相容性(incompa
6、tibility)利用同一复制系统不同质粒不能稳定的和平共处的生存，称为质粒的不相容性，有时又称不亲和性，是指在没有选择压力情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞中稳定地共存现象。在细菌增殖过程中，其中一种质粒必然会丢失。分子克隆技术正基于质粒的不相容性质，在只带有一种质粒的细菌中，提取单一的DNA。3.质粒的转移性革兰氏阴性细菌的质粒分为接合型质粒(Conjugativeplasmid)，又叫自我转移质粒。它们既具有自我复制遗传信息，又具有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。接合型质粒多属于严紧型质粒。非接合型质粒(non-conj
7、ugativeplasmid)也叫不能自我转移的质粒。因为它们仅仅带有自主复制的遗传信息。非接合型质粒多属于松驰型质粒。1）质粒的类型非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一种接合型质粒，那么它们通常也是可以被转移的。这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫质粒的迁移作用（mobiligation）又叫质粒的诱动。带有大肠杆菌素基因的Col质粒和带有抗菌素抗性基因的R质粒既有属于接合型的，也有属于非接合型的。如果在非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一种接合型质粒，那么它们通常也是可以被转移的。这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫质
8、粒的迁移作用(mobilization)又叫质粒的诱动。ColE1是一种可以迁移
