基因工程载体构建

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1、黄酮醇合成酶基因原核表达载体的构建与黄酮合成酶Ⅱ和黄酮醇合成酶真核表达载体的构建黄酮类化合物是一类多酚类化合物，广泛存在于自然界，根据对中心C环的不同修饰，可以分为黄酮、异黄酮、黄烷酮、黄酮醇和花青素等主要酮醇类化合物广泛分布于多种植物中，研究表明，它们是与几种细胞内传导和细胞转化有关激酶的抑制剂，具有多种生物学活性。由于它们能有选择地阻断细胞内信号传导通路，因此黄酮类化合物被认为是资料癌症的潜在化合物。黄酮是由黄酮合成酶催化黄烷酮形成的。在植物中，存在两种黄酮合成酶，即黄酮合成酶I(flavonesynt

2、haseI，FSI)和黄酮合成酶II(flavonesynthaseII，FSII)。FSI是可溶性的，存在有些伞形科植物中，它是2．氧代戊二酸依赖的酶；FSII存在于大多数植物中，属于细胞色素P450单氧化酶，催化反应依赖于NADPH，是催化生成黄酮的关键酶。黄酮合成酶通过在黄烷酮C一2、C．3之间引入双健形成黄酮。黄酮醇合成酶（FLS）作为黄酮类合成途径与儿茶素合成途径的桥梁，在植物中非常保守，它催化黄酮结构中的C3位羟基化，从而形成了各类黄酮醇类物质。一、材料T载体：pMD18-T_Vector原核表

3、达载体：pET-28a(+)真核表达载体：pBⅠ121和pCAMBIA-1304二、载体构建1．洋桔梗FSⅡ基因cds序列的获得洋桔梗FLS基因cds序列的获得以洋桔梗的FLS为例洋桔梗FLS基因的克隆提取洋桔梗叶片RNA，并以之为模板在反转录酶的作用下合成cDNA第一链。根据NCBI上公布的编码的FLScDNA序列，根据设计合成一对特异引物，在其5’端引物的上游加入NcoⅠ酶切位点，在其3’端引物的上游加入NheⅠ酶切位点。以反转录的cDNA第一链为模板PCR扩增洋桔梗FLS基因。引物F:5'-gccca

4、tggatggaggtgcaaagagtgca-3'（NcoⅠ）引物R:5'-gcgctagctcactgtggaagcttattga-3'（NheⅠ）FLSNcoINheI2、PCR产物与T-Vector连接：pmd18-TFLSNcoINheI用DNA连接酶进行连接，连接产物用Ca2+借介导法转化大肠杆菌感受态，并在含Amp的培养基上筛选，PCR检测并测序，得到正确目的基因。pET-28a(+)NcoINheI（3）目的片段与表达载体的双酶切及连接pmd18-TFLSNcoINheINcoⅠ和NheⅠ双

5、酶切NcoⅠ和NheⅠ双酶切T4DNA连接酶连接pET-F3'5'HF3'5'HNheINcoI连接产物转化大肠杆菌，并在含Kan的培养基上筛选，PCR检测并测序，得到正确表达载体。重组载体转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达，并检测目的产物表达情况。3．真核表达载体的构建（1）FSⅡ和FLS基因的扩增并与T-Vector连接（步骤同原核表达载体构建）引物F:5'-gcccatggatggaggtgcaaagagtgca-3'（XbaⅠ）引物R:5'-gcagatctctaagaaatgtaagcactt-3'

6、（SacⅠ）FSⅡXbaⅠSacⅠ引物F:5'-gcagatctatgtctccattgattgttgc-3'（BglⅡ）引物R:5'-gcggtnactcactgtggaagcttattga-3'（BstEⅡ）FLSBglⅡBstEⅡPCR产物与T-Vector连接：pmd18-TF3HBglⅡBstEⅡⅡIpmd18-TF3'5'HXbaⅠSacⅠⅡI（2）pBI121-F3'5'H表达框的构建pmd18-TFSⅡXbaⅠSacⅠⅡIpBI121gusANOSterCaMV35SEcoRIHindIII

7、XbaISacIpBI121-F3'5'HF3'5'HNOSterCaMV35SEcoRIHindIIIXbaISacIXbaⅠ和SacⅠ分别进行双酶切，获得FSⅡ基因和载体T4DNA连接酶连接连接产物转化大肠杆菌，并在含Kan的培养基上筛选，PCR检测并测序，得到正确的pBI121-FSⅡ表达框。（3）pCAM-FSⅡ-FLS双元表达载体的构建pCAMBIA-1304载体经BglⅡ和BstEⅡ双酶切后，与目的基因FLS连接，构成pCAM-FLS，再经HindⅢ和EcoRⅠ双酶与pBI121-FSⅡ表达框连

8、接，构成pCAM-FSⅡ-FLS双元表达载体。pmd18-TFLSBglⅡBstEⅡⅡIpCAMBIA-1304gfpgusCaMV35SBglⅡHYG(R)EcoRIHindIIIBstEⅡBglⅡ和BstEⅡ双酶切T4DNA连接酶连接pCAMBIA-FLSF3HCaMV35SHYG(R)BglⅡBstEⅡEcoRIHindIIIpBI121-FSⅡFSⅡNOSterCaMV35SEcoRIHindIIIXba