CHAPTER 8 分子克隆载体.ppt

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1、分子克隆载体ThevectorsinthemolecularcloningChapter8Chapter8分子克隆载体质粒载体噬菌体载体人工染色体载体表达载体Vector载体：将外源DNA或基因携带进入宿主细胞的工具称为载体特征：能够自我复制(具备复制原点)酶切位点选择标记较高的拷贝数载体介绍plasmid:small,extrachromosomalcircularmolecules,from2to~200kbinsize,whichexistinmultiplecopieswithinthehostcells.第一节质粒载体1.质粒的复制复制起始区和顺式

2、作用元件2.质粒的拷贝数严谨型和松弛型一、质粒的基本特征3.质粒的不相容性两个质粒在同一宿主中不能共存(不能共用同一复制系统)。4.转移性质粒可通过细菌结合的作用转移到新宿主细胞内。一、质粒的基本特征1.选择标记基因用于鉴别目的DNA的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。最广泛使用的是抗生素基因：ampr，tetr，kanr，neor等。二、标记基因2.筛选标记基因用于区别重组质粒与非重组质粒，当一个外源DNA片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒。二、标记基因选择标记和筛选标记(1)α-互补是指lacZ(β-半乳糖苷酶)基因上

3、缺失近操纵基因区段(Operator区)的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶的突变体之间实现互补。2.筛选标记基因当载体带有lacZ调节序列和编码β-半乳糖苷酶N末端146个氨基酸的序列，而宿主中该部分序列缺失其他部分完整时，虽然宿主编码的或质粒编码的片段本身都没有活性，但它们相互协作则可形成有酶活性的蛋白，在诱导物IPTG存在下，细菌在含色素底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)培养基上形成蓝色菌落，当在质粒上插入外源DNA，使β-半乳糖苷酶N末端失活，从而就不能进行α-互补，因此带有重组质粒的细菌产生白色菌落。α-互补

4、原理Recreatedvector:bluetransformantsRecombinantvector:containinginsertedDNA:whitetransformantsRecreatedvector(noinsert)Recombinantvector(containinsert)lac操纵子调节序列β-半乳糖苷酶N末端146个氨基酸序列IPTG载体上能合成N末端β-半乳糖苷酶缺陷型细胞有活性的β-半乳糖苷酶互补在含X-gal培养基上显蓝色菌落插入外源DNAβ-半乳糖苷酶IPTG载体上不能合成N末端β-半乳糖苷酶缺陷型细胞不互补无活性的β-

5、半乳糖苷酶在含X-gal培养基上显白色菌落(2)插入失活质粒pBR322具有tetr基因和ampr基因，当外源DNA插入tetr基因后，导致tetr基因失活，只有ampr抗性。1.克隆载体主要用于克隆和保存DNA片段。2.表达载体来源于克隆载体，增加了强启动子等元件，有利于表达产物分泌、分离、纯化三、质粒载体的种类克隆载体克隆载体表达载体第二节λ噬菌体载体1.基因组大小：双链DNA，48,502bp2.感染宿主后进入：容原状态，将λ噬菌体基因组DNA通过位点专一性重组整合到宿主的染色体中，并随宿主的繁殖传递给子代。裂解循环，大量复制并装配成子代λ噬菌体颗粒，

6、导致宿主细胞裂解。一、λ噬菌体的分子生物学1.λphageLifecyclevirusesthatcaninfectbacteria.48.5kbinlengthLinearorcirculargenome(cosends)λphageLyticphase(Replicateandrelease)Lysogenicphase(integrateintohostgenome)λreplacementvectorReplacethenonessentialregionofthephagegenomewithexogenousDNA(~20kb)hightrans

7、formationefficiency(1000-timehigherthanplasmid)λreplacementvector2.PackingwithamixtureofthephagecoatproteinsandphageDNA-processingenzymesLigation3.InfectionandformationofplaquesPlaques(噬菌斑):theclearareaswithinthelawnwherelysisandre-infectionhavepreventedthecellsfromgrowing.Recombin

8、antlDNAmaybepurifiedfromph