基因克隆的酶学基础

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1、第三章基因克隆的酶学基础限制性核酸内切酶切割DNADNA连接酶生成3’-5’磷酸二酯键DNA聚合酶Ⅰ探针标记、补平3’末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5’磷酸化、探针标记末端转移酶3’末端多聚尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基常用的工具酶：第一节限制性核酸内切酶第二节DNA连接酶第三节DNA聚合酶第四节DNA及RNA的修饰酶第五节核酸外切酶第六节单链核酸内切酶一、寄主控制的限制与修饰二、Ⅱ型限制酶的特点三、影响内切酶活力的因素四、核酸内切酶对DNA的消化作用五、限制酶的用途第一节限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割一、寄主控制的限制与修饰人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一

2、些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。修饰的甲基转移酶作用：保护自身DNA不受限制；破坏外源DNA使之降解E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其D

3、NA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。数字表示在不同寄主中生长的噬菌体的成斑率，表示限制程度。二．限制和修饰作用的分子机制1．大肠杆菌宿主细胞K株，B株，有各自的限制和修饰系统。1）它们均有三个连续的基因位点控制，hsdR;hsdM;hsdS.2）hsdR编码限制性核酸内切酶---识别DNA分子特定位点，将双链DNA切断。（DNA分子转化细胞：受体细胞去掉hsdR基因

4、位点）3）hsdM编码产物是DNA甲基化酶---催化DNA分子特定位点的碱基甲基化反应。4）hsdS表达产物的功能是---协助限制性核酸内切酶和甲基化酶，识别特殊的作用位点。限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源DNA的一类酶，其功能是避免外源DNA的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。根据酶的功能、大小和反应条件，及切割DNA的特点，可以将限制性内切酶分为三类：Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、Ⅲ型酶2、限制性内切酶的类型（1）Ⅰ型酶：1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分离出

5、的核酸内切酶。分子量较大，反应需Mg2+、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点，而且切割是随机的，所以在基因工程中应用不大。（2）Ⅱ型酶1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血菌Rd株中分离出来的限制酶。分子量较小（105Da），只有一种多肽，通常以同源二聚体的形式存在。反应只需Mg2+的存在，并且具有以下两个特点，识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。许多Ⅱ型酶切割DNA后，可在DNA上形成粘性末端，有利于DNA片段的重组。（3）Ⅲ型酶这类酶可识别特定碱基顺序，并在这一顺序的3

6、’端24~26bp处切开DNA，所以它的切割位点也是没有特异性的。二、限制性内切酶的特点1、定义、命名（1）定义广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II型限制酶。（2）命名限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。例如：HindⅢ前三个字母来自于菌种名称H.influenzae，“d”表示菌系为d型血清型（菌株号）；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。EcoRI—EscherichiacoliRI2、限制酶的特点（1）基本特点在DNA双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子，产生链的断裂。两个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的因此，断裂的结果形成的DN

7、A片断，也往往具有互补的单链延伸末端。（2）识别顺序和酶切位点①识别４-8个相连的核苷酸MboINGATCNAvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCCPpuMIPuGG(A/T)CCPy估算RE识别序列在DNA上出现的频率:识别序列的频率=1/4nSau3A(4bp)=1/44256bpEcoRI、PstI(6bp)=1/464096NotI(8bp)=1/4865536(rarecutters)仅是理论推测②对称性③限制酶切后产生两个末端，末端结构是5’-P和3’-OHEcoRI5