基因克隆酶学基础.ppt

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1、第四章分子克隆的酶学基础基因的重组与分离，涉及到一系列相互关联的酶促反应。特别是核酸限制性内切酶和DNA连接酶的发现和应用，使DNA分子的体外连接与切割成为可能。核酸限制性内切酶和DNA连接酶是重组DNA技术赖以创立的重要酶学基础。重组DNA实验中常使用的酶II型核酸内切限制酶DNA连接酶大肠杆菌DNA聚合酶反转录酶多核苷酸激酶末端转移酶核酸外切酶IIIλ核酸外切酶碱性磷酸酶S1核酸酶Bal31核酸酶TaqDNA聚合酶DNA的一级结构DNA的二维结构核酸酶通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的蛋

2、白酶叫做核酸酶。专门水解断裂RNA分子的叫做核糖核酸酶（RNase)；特异水解断裂DNA分子的则叫做脱氧核糖核酸酶（DNase）。从核酸分子末端开始,一个核苷酸一个核苷酸地消化降解多核苷酸链,称为核酸外切酶（exonuclease）；从核酸内部切割磷酸二酯键使之断裂为小片段的为核酸内切酶（endonuclease）。第一节、核酸内切限制酶与DNA分子的体外切割寄主控制的限制与修饰现象(R/M)修饰的甲基转移酶核酸内切限制酶EcoBEcoK（Restrictionandmodification）E.coli菌株λ噬菌体感染率KBCE.

3、coliK110-410-4E.coliB10-4110-4E.coliC111说明K和B菌株中存在一种限制系统可排除外来的DNAGAATTCCTTAAGEcoRIMEcoRI限制作用修饰作用G3’5’AATTCCTTAA5’3’GGAATTCCTTAAGMeMeMeEcoRI核酸内切限制酶EcoRI及其修饰的甲基化酶MEcoR的限制与修饰作用寄主的限制与修饰的作用保护自身的DNA不受限制;破坏外源DNA,使之迅速降解2.限制酶的发现60年代提出了限制性内切酶和限制酶的概念1968年，首次从E.coliK中分离到限制酶有特定的识别位点但没

4、有特定的切割位点，切割位点离识别位点达1000bp以上。1970年，美国约翰·霍布金斯大学的H.Smith找到HindⅡ限制性内切酶。2006年2月为止共发现3773种限制酶,810种甲基化酶核酸内切限制酶(restrictionendonuclease)是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4-8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶3.核酸内切限制酶的类型特性I型酶II型酶III型酶蛋白质结构3种亚基单一成分2种不同亚基辅助因子ATP,Mg2+,S-MetMg2+ATP,Mg2+,S-Met序列特异切割不是是是切割位

5、点距识别序列1kb处随机切割识别序列内或附近距识别距离下游24-26bp处克隆中的作用无用十分有用用处不大4.II型核酸内切限制酶的基本特性在特异识别序列切割DNA分子；两个单链切割部位在DNA分子上的分布,通常不直接相对；断片往往具有互补的单链延伸末端。(1)基本特性识别序列4-8个核苷酸序列①大部分呈旋转对称、反向重复结构—回文结构C-C-G-C-G-GG-G-C-G-C-C对称轴切割位点切割位点ABCC΄B΄A΄ABB΄A΄A΄B΄C΄CBAA΄B΄AB②部分识别序列不对称:AccBSⅠ:CCG↓CTCGGC↑GAGBssSⅠ:C↓

6、TCGTGGAGCA↑C③有一些限制酶可识别多种序列AccIGTMKAC(M:A或C)HindIIGTYRAC(Y:C或R:A或G)识别位点在DNA分子中的频率假定核苷酸随机排列的情况下进行实践中:如λDNA长49kb，对于六碱基的酶应该有12个切割位点，实际上要少一些，如BglII只有6个，BamHI只有5个，而SalI只有2个。44=25646=4096基因组中碱基对的排列是非均匀的，尽管有的酶切序列中GC含量相同，但在基因组中出现的机率还是不一样。在E.coli中AsoⅠ（GGCGCGCC）20kbNotⅠ（GCGGCCGC）20

7、0kb（常利用它出现的机会少来构建图谱）EcoRⅠ和HindⅢ5kbSpeⅠ（ACTAGT）60kb细菌基因组（Bacteriagenome)大多数富含A+T的细菌中，CCC和CGG的排列是最少见的，所以含有这两种序列的识别序列出现的几率就非常少。酵母基因组（Yeastgenome)G+C含量38%，在重复序列之外，富含G+C的识别序列就特别少。哺乳动物中含CG序列的酶切位点稀少，大多CG序列是甲基化的(2)、限制性内切酶产生的末端粘性末端Cohesiveends(Machedends)5‘粘性末端,3’突出末端平末端Bluntends非

8、对称突出端①粘性末端Cohesiveends(Machedends)DNA分子在限制性内切酶的作用下形成具有互补碱基的单链延伸末端结构,能够通过互补碱基的配对而重新连接起来.EcoRI切割位点