毛绒鬼伞漆酶基因的克隆1

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1、毛绒鬼伞漆酶基因的克隆摘要：综合运用苯胺蓝平板脱色法和愈创木酚法对毛绒鬼伞菌是否会产生木质素降解酶进行简单定性分析。之后，运用cDNA末端快速扩增（RapidAmplificationofcDNAEnds,RACE)技术去克隆一个鬼伞的漆酶结构基因和其对应的全长cDNA,并对其序列进行分析。关键词：定性分析，cDNA末端快速扩增，漆酶基因1绪论1.1木质素简介1.1.1基本概念木质素是由聚合的芳香醇构成的一类物质，存在于木质组织中，主要作用是通过形成交织网来硬化细胞壁。木质素主要位于纤维素纤维之间，起抗压作

2、用。在木本植物中，木质素占25%，是世界上第二位最丰富的有机物(纤维素是第一位)。1.1.2单体与结构　　木质素是由四种醇单体（对香豆醇、松柏醇、5-羟基松柏醇、芥子醇）形成的一种复杂酚类聚合物。木质素是构成植物细胞壁的成分之一，具有使细胞相连的作用。木质素是一种含许多负电集团的多环高分子有机物，对土壤中的高价金属离子有较强的亲和力。　　因单体不同，可将木质素分为3种类型：由紫丁香基丙烷结构单体聚合而成的紫丁香基木质素（syringyllignin，S-木质素），由愈创木基丙烷结构单体聚合而成的愈创木基木质

3、素（guajacyllignin，G-木质素）和由对-羟基苯基丙烷结构单体聚合而成的对-羟基苯基木质素（hydroxy-phenyllignin，H-木质素）；裸子植物主要为愈创木基木质素（G），双子叶植物主要含愈创木基-紫丁香基木质素（G-S），单子叶植物则为愈创木基-紫丁香基-对-羟基苯基木质素（G-S-H）。从植物学观点出发，木质素就是包围于管胞、导管及木纤维等纤维束细胞及厚壁细胞外的物质，并使这些细胞具有特定显色反应（加间苯三酚溶液一滴，待片刻，再加盐酸一滴，即显红色）的物质；从化学观点来看，木质素

4、是由高度取代的苯基丙烷单元随机聚合而成的高分子，它与纤维素、半纤维素一起，形成植物骨架的主要成分，在数量上仅次于纤维素。木质素填充于纤维素构架中增强植物体的机械强度，利于输导组织的水分运输和抵抗不良外界环境的侵袭。　　木质素在木材等硬组织中含量较多，蔬菜中则很少见含有。一般存在于豆类、麦麸、可可、巧克力、草莓及山莓的种子部分之中。其最重要的作用就是吸附胆汁的主要成分胆汁酸，并将其排除体外。　　另外，虽然其详细情况目前尚不得而知，但木质素的构造与多酚非常相似，故此，木质素与多酚应该有密切的关系。总之，二者对于

5、身体都有很好的作用。木质素单体的分子结构1.2木质素降解酶系木质素的降解酶系是非常复杂的体系，目前对它的研究较多，认为最重要的木质素降解酶有3种：木质素过氧化物酶(LigninperoxidaseLip)、锰过氧化物酶(ManganeseperoxidaseMnp)和漆酶(Laccase)。除此之外，还有芳醇氧化酶(Ary1．alcoholoxidaseAAO)、乙二醛氧化酶(GyoxaloxidaseGLOX)、葡萄糖氧化酶(Gu．cose1．oxidase)、酚氧化酶、过氧化氢酶等都参与了木质素的降解或

6、对其降解产生一定的影响。1.3漆酶漆酶（英文名称:Laccases　　CAS编号：80498-15-3）　　借助氧将对苯二酚（氢醌）氧化成对苯醌的酚氧化酶的一种，亦称为对苯二酚氧化酶。田彦六郎（1883）在漆树的树液中发现能使“树漆”氧化硬化的酶，后来贝特兰德（G．E．Bertrand，1894）详细地研究了东南亚产的漆中的酶，命名为漆酶。也分布于微生物、菌类中。是一种铜蛋白质，蓝色，分子量约12万，含4原子铜。可被CN-抑制。在漆树的永延液汁中可被此酶氧化变成黑色色素的物质是漆酚、氢化漆酚等。　　漆酶(L

7、accases)是一种结合多个铜离子的蛋白质，属于铜蓝氧化酶，存在菇、菌及植物中。漆酶可存活于空气中，发生反应后唯一的产物就是水，因此本质上是一种环保型酵素。由于这几年环保意识逐渐被人所重视，因此近年来漆酶也成为众多学者的研究对象。　　漆酶独特的催化特性使其在生物检测中有广泛的应用,作为高效的生物检测器而成为底物、辅酶、抑制剂等成分分析的有效工具和手段。漆酶构成的生物检测器主要有两种:漆酶电极和漆酶酶标。　　此产品是一种浓缩原酶，他复配用来保证在处理过程中保持PH值在6.0-4.8的范围。不过特别在剂量比较

8、小的情况下，要用醋酸来调PH值。漂白程度很容易由他使用的剂量多少来控制。由于他可以停止反应，工艺控制非常简单。无需另外灭酶活.2实验操作2.1实验材料2.1.1酶和试剂①限制性内切酶、限制性内切酶、T4DNA聚合酶、T4DNA连接酶、Ex．TaqDNA聚合酶。②4种dNTP和OneStepRT．PCRKit，TRIzol试剂，OligotexmRNAMiniKit，DNA纯化试盒。③愈创木酚、苯胺蓝。2.1.2菌