脂肪变肝细胞中解偶联蛋白2表达的变化

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1、脂肪变肝细胞中解偶联蛋白2表达的变化：朱亚男，冯堃，王炳芳，何敖林【摘要】目的：探讨解偶联蛋白2（UCP2）在正常肝细胞及不同程度脂肪变肝细胞中的表达情况。方法：用不同浓度的脂肪乳剂培养肝细胞，使其发生不同程度的脂肪变，作为脂肪变的肝细胞模型。正常细胞作为对照组，另设三组为模型组，其培养液内脂肪乳剂的浓度分别0.5,1.0，2.0μl/ml。应用RTPCR技术检测细胞内UCP2mRNA表达水平，蛋白质印迹检测UCP2的表达情况。结果：正常肝细胞内可以检测到UCP2mRNA表达，且随着脂肪乳剂浓度的不断增加，脂肪变肝细胞内UCP2mRNA相对表达量也增加。模型组与正

2、常对照组表达量差异有统计学意义（P<0.01），模型组之间的表达量差异也具有统计学意义（P<0.01）。正常组内未检测到UCP2蛋白，模型组中随着肝细胞脂肪变程度的加重，UCP2蛋白表达也增加（P<0.05）。结论：脂肪变性的肝细胞中UCP2表达较正常肝细胞增加，且表达随脂肪变程度的加重而增加。【关键词】肝细胞;表达;解偶联蛋白2;脂肪变［Abstract］Objective:Toresearchtheexpressionofuncouplingprotein2innormalhepatocytesandfattylivercells.Method

3、s：Culturedhepatocytesulsion,thecellsgotsteatosistovaryingdegreeandmadethemasthemodeloffattylivercells.Normalcellsusedascontrol,culturedthemodelcellsediumcontainingdifferentconcentrationoffattyemulsionasfollol.TestifiedtheUCP2expressionbyRTPCRandalcellscontainUCP2mRNA,andthehigherthefa

4、ttyemulsion,themoretheUCP2mRNAexpression（P<0.01）.Therealcells,andinmodelcellstheUCP2proteinincreasedinaccordanceulsion（P<0.05）.Conclusion：TheexpressionofUCP2infattylivercellsalones,andtherel玻璃培养瓶），分别标记为1组、2组、3组、正常组。细胞铺满瓶底50%～60%时可换液并施加干预，每组5瓶。正常组仍旧为常规培养液，1组、2组、3组培养瓶中加入20%脂肪乳剂，确保其

5、浓度分别为0.5，1.0，2.0μl/ml，脂肪乳剂培养48h后，用油红O染色肝细胞（一种亲脂性染料）。显微镜下观察，染色显示细胞内有不同程度的红色脂滴积聚，细胞折光性变弱，在电镜下可以发现发生脂肪变性的肝细胞内折光颗粒增多，说明细胞发生了不同程度的脂肪性损伤，我们前期的实验也证实此种造模方法是可行的，可以作为脂肪变性的肝细胞模型以进行下一步研究［3］。1.2.2RNA的提取和逆转录聚合酶链反应（RTPCR）①提取总RNA和逆转录：细胞干预完成后，PBS漂洗两遍，加入Trizol试剂，提取步骤按说明书操作。提取完成后，紫外分光光度计测定D（260nm）/D（28

6、0nm）>1.6,琼脂糖凝胶电泳显示28S亚基为18S亚基RNA的2倍，说明所提取的RNA质量符合要求。按逆转录试剂盒说明书操作合成cDNA。②引物合成：UCP2，GAPDH的引物由上海生工生物工程有限公司设计及合成，UCP2上游引物序列5′CCGGTTACAGATCCAAGGAGAA3′；下游引物序列5′TCAGAATGGTGCCCATCACA3′；PCR扩增产物长度为84bp。GAPDH上游引物序列5′CCACTCCTCCACCTTTGAC3′；下游引物序列5′ACCCTGTTGCTGTAGCCA3′；PCR扩增产物长度为100bp。③PC

7、R：PCR反应条件94℃预变性4min,94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环，最后72℃延伸10min结束循环。PCR扩增的产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳并与DNA标准分子质量比较鉴定。用BioRad凝胶成像系统进行图像分析，用目的基因条带与GAPDH条带光密度值之比来表示目的基因mRNA的相对含量。1.2.3总蛋白的提取和定量细胞干预完成后，PBS漂洗两遍，按照总蛋白提取试剂说明书操作，BCA法进行蛋白定量，沸水浴中煮5min，-70℃保存待用。1.2.4蛋白质印迹操作分析每泳道上样量为40μg，用12%SDSPAGE电泳分离蛋白样