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1、癌症高表达蛋白在肝细胞肝癌中的表达及意义张鹏李卫华,杨涛,党军强,陈勇【关键词】,癌症高表达蛋白;,肝细胞肝癌;,细胞周期 [摘要]目的:研究癌症高表达蛋白(Hec1)在原发性肝细胞肝癌(HCC)中的表达和意义。方法:采用免疫组化SP法检测27例正常肝组织、30例癌旁组织及62例HCC组织中Hec1的表达;用SF、Aprotinin为Sigma公司产品,其余试剂为国产分析纯。 1.2方法 1.2.1免疫组化染色采用链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶(SP)免疫组织化学方法,具体操作按试剂说明书进行。以微波枸橼酸盐进行抗原
2、修复,DAB显色,同时用PBS代替一抗作阴性对照,用预实验中已知的Hec1表达阳性片作阳性对照。结果判断:Hec1以细胞核染成淡黄或棕黄色为阳性,在400倍光镜下观察20个视野,每个视野计数200个细胞,阳性细胞数记分:5%为0分,5%～25%为1分,26%～50%为2分,51%～75%为3分,>75%为4分;染色强度记分:淡黄色为1分,黄色为2分,棕黄色为3分;组织化学积分(两记分的乘积):>1为阳性,≤1为阴性。 1.2.2SF,1mg/LAprotinin,40mmol/LDTT和去离子水,置于冰上,
3、将组织碾碎后放置1.5～2.0h,匀浆器匀浆;4℃,12000r/min离心20min,取上清匀浆用Bradford法测定上清液中总蛋白的浓度,分装于-70℃冰箱备用。将总蛋白煮沸变性10min,以50μg/孔上样,在120g/L的SDSPAGE凝胶中进行电泳分离,电泳完毕后,通过电转移法将蛋白质从SDSPAGE凝胶转移至PVDF膜。TBST洗涤后PVDF膜在含50g/L脱脂奶粉的TBST中37℃封闭90min,加入一抗(鼠抗人Hec1抗体,稀释度1∶1000)4℃孵育过夜,TBST充分漂洗(10min×3次),加入二抗
4、(辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG,稀释度1∶1000)37℃作用1h,TBST充分漂洗(10min×3次)后,化学荧光法(ECL)显色,结果用凝胶成像仪扫描,用软件分析。以待测蛋白Hec1条带与内参照GAPDH条带灰度值的比值作为指标。 1.2.3统计学处理采用SPSS10.0软件对数据资料进行分析。组间率的比较采用χ2检验,Fisher确切概率法。Westernblot结果比较采用单因素方差分析。 2结果 免疫组化结果显示,正常肝组织中Hec1蛋白未见表达,癌旁组织中Hec1蛋白表达阳性率为20.8%（5/24
5、）,HCC组织中Hec1蛋白表达阳性率为62.9%（39/62）,各组织中Hec1蛋白的表达差异均有统计学意义(P0.05)。Hec1蛋白的表达与HCC的Edmondson分级、侵袭转移显著相关（图1、表1）。 图1Hec1的表达 略 表1Hec1表达与临床病理特征的关系 略 r72000处有一条特异性条带,与Hec1的分子量相符,表明有Hec1蛋白的表达。正常肝组织中Hec1蛋白无表达;癌旁组织中Hec1蛋白平均表达量的灰度值为0.12±0.03;HCC组织为0.89±0.16（图2)。HCC组织中Hec1蛋白表
6、达水平明显高于正常肝组织和癌旁组织,差异有统计学意义(P0.05)。 图2r为72000。Hec1mRNA在有丝分裂期明显增多,且在S到M期升高尤为明显。细胞周期检查点(mitoticcheckpoint)是保证细胞周期中DNA复制和染色体分配质量的检查机制。是真核细胞维持基因组完整性并使致肿瘤倾向最小化的机制之一。在哺乳动物细胞中,检查点的缺失或检查点功能的损伤可以导致染色体的不稳定和癌症的发生。在一些癌细胞中检查点功能的丧失被认为与它们抗肿瘤治疗（如化疗和放疗）的敏感性有关。研究表明,Hec1具有召集Mad1/Ma
7、d2和Mps1复合物结合到着丝粒上的作用[1,2],这种结合可以激活纺锤体组装检查点途径中非常重要的APCCdc20途径[3]。通过RNAi方法使Nuf2和Hec1基因沉默后发现这两种蛋白是Mad1和Mad2结合与固定在着丝点所必需的[4]。Hec1失活导致严重且致死的有丝分裂进程的瓦解[3,5]。本研究显示,Hec1蛋白在HCC中的表达率为62.9%,癌旁组织表达率为20.8%,正常组织未见阳性表达。阳性表达差异具有统计学意义。Hec1蛋白的表达与HCC的Edmondson分级、侵袭转移显著相关相关,与年龄、肿块直径、
8、肝功Child分级无关。oreeB,HickeyJM,etal.hNuf2inhibitionblocksstablekiochoremicrotubuleattachmentandinducesmitoticcelldeathinHeLacells[J].JCellBiol,2002,159(4):549-555.
