结核分枝杆菌ag85b成熟蛋白基因免疫

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1、结核分枝杆菌Ag85B成熟蛋白基因免疫　　摘要:目的研究已构建的编码结核分枝杆菌（Mycobac-teriumtuberculosis，MTB）H37Ra株Ag85B成熟蛋白基因的真核表达质粒pTB30m的表达和免疫原性.方法以电穿孔法将pTB30m转染CHO细胞，RT-PCR法检测转染细胞中Ag85B特异的mRNA的表达.将pTB30m质粒肌注免疫BALB/c和C57BL/6小鼠，ELISA法检测基因免疫的体液免疫应答效果.分离免疫小鼠的脾淋巴细胞，体外用抗原再刺激，生物学方法检测IFNγ产生水平和MTT法检测淋巴细胞增殖.结果RT-PCR检测证实pTB30m

2、可在CHO细胞中表达.pTB30m免疫小鼠可引起较高水平的Ag85B特异性的抗体应答.免疫小鼠的脾淋巴细胞，体外用抗原再刺激，淋巴细胞增殖显著，BALB/c和C57BL/6小鼠IFNγ的量分别达到1360ngL-1和1965ngL-1，而生理盐水和空质粒对照组均低于80ngL-1.结论应进一步研究pTB30m作为TB的基因疫苗用于TB的防治的效果.　　Keytuberculosis;vaccines，DNA;genes;immunity;immunogenicity;Ag85B　　Abstract:AIMToinvestigatetheexpressionand

3、immuno-genicityofrebinanteukaryoticexpressionplasmidpTB30mencodingmatureformofAg85BofMycobacteriumtuberculosisH37Rastrain.METHODSpTB30mRNA.AfterBALB/candC57BL/6mice，ELISAmunizedmicesera.LevelofIFNγsecretedbysplenocytesofimmunizedmiceup-onantigen-specificstimulationmunizedmiceinrespon

4、setoantigenrestimulationeasuredbyMTTmethod.RESULTSpTB30minducedhighertiterspecificantibodyagainstAg85Binimmunizedmiceandprotectivecell-mediatedimmunity，characterizedbysplenocytesulationsecretedincreasedlevelsofIFNγandproliferatedsignificantly.CON┐CLUSIONpTB30mshouldbefurthertestedasD

5、NAvac-cineofTBinpreclinicalanimalmodels.　　0引言　　结核病（tuberculosis，TB）是长期危害人类健康的严重疾病之一.尤其是近年来耐药结核分枝杆菌（DRMTB）的流行，以及MTB和HIV双重感染，导致TB的发病率和死亡率大幅度上升.目前，TB已成为传染病中的头号杀手.BCG接种是预防TB的重要措施，但其预防效果不稳定.寻求新的TB防治措施是当务之急.MTB基因疫苗的研究可能是解决此问题的方法之一，并已成为当前国内外研究的热点.我们已构建了编码MTBAg85B成熟蛋白基因的真核表达载体［1］.在此，我们进一步研究了

6、该重组载体在体外的表达和在小鼠体内诱生体液免疫和细胞免疫应答的能力.　　1材料和方法　　1.1材料pTB30m质粒是编码MTBAg85B成熟蛋白基因的真核表达质粒，由构建［1］.pcDNA3质粒、E.coliJM109宿主菌和CHO细胞系由本室保存.MTBH37Rv株由陕西省结核病防治研究所王瑞副主任技师惠赠.RPMI1640，DMEM，HEPES和SuperscriptTMII逆转录试剂盒购自GIBCO公司.TaqDNA聚合酶、dNTPs和PolyATtract○RSystem1000购自Promega公司.Nucleotrap小量DNA纯化试剂盒购自Clon

7、tech公司.PEG8000购自原平皓公司.新生牛血清、BglⅡ，羊抗鼠IgG-HRP为华美公司产品.P1，P2引物由西安美联公司合成［1］.大肠杆菌重组表达的Ag85B标准品由加州大学HarthG.博士赠送.布吡卡因是上海天丰制药厂产品.IFNγ标准品购自晶美公司（PeproTechEC产品，England），MTT购自Sigma公司.电穿孔仪是BIO-RADGenePulserⅡ.BALB/c和C57BL/6雌性小鼠，6～8和pcDNA3分别转化E.coliJM109宿主菌，经酶切鉴定筛选阳性克隆.将阳性克隆分别接种于5mLLB液体培养基（含Amp100mg

8、L-1），37℃振荡培养