结核分枝杆菌ag85b

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1、结核分枝杆菌Ag85B：师长宏，范雄林，柏银兰，薛莹，张海，徐志凯【关键词】,分支杆菌　　【Abstract】AIM:ToevaluatehumoralandcellmediatedimmuneresponsebyAg85BandESAT6fusionproteinsandtotesttheirprotectiveefficacyagainstMycobacteriumtuberculosis(MTB)challenge.METHODS:BALB/cmicemunizedthreetimesata2ousebackrespectivelyembranebeforehand.T

2、hespleenlymphocytesoftheimmunizedmicestimulationindex(SI)easuredbyMTTmethodandthelevelofsecretedIFNγulationicebersofCFUinspleensined.RESULTS:ThetiterofseraspecificantibodyinBALB/cmiceimmunizedmunizedgroupsmunizedgroupsrespectively)thanthatofsalineimmunizedgroup(0.90±0.21).TheIFNγlevelsincul

3、turesupernatantofspleenlymphocytesfromthefusionproteinsimmunizedmicemunizedgroupsrespectively,significantdifferentfromthoseofsalineimmunizedgroup(0.50±0.25)μg/L,P<0.05,etteGuerin(BCG)immunizedgroup(5.55±0.31)μg/L.paredmunizedmice（bacterialoadaticreductionsofMTBreplicationiceimmunizedicei

4、mmunizedtuberculosis;vaccines；Ag85B；ESAT6；rebinantfusionproteins　　【摘要】目的：研究Ag85B与ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫应答以及对MTB感染小鼠的保护力.方法：采用皮下包埋的方法，将预先转移到硝酸纤维素膜上的表达蛋白免疫小鼠3次，每次间隔2indextrosecatalase,ADC）和RPMI1640培养基均购自GIBCO公司.MTB的CFP由本室制备.羊抗鼠IgGHRP购自华美生物公司.6~8周龄BALB/c小鼠，雌性，由第四军医大学实验动物中心提供，饲养于该中心P3级感染实验室.　

5、　1.2方法　　1.2.1MTB毒株H37Rv的培养和定量取罗氏培养基中保存的MTB毒株H37Rv接种到7H9培养基（含100g/LADC和0.5g/LTin离心10min，收集细菌，保存于-20℃备用.用7H9液体培养基系列稀释浓缩液，接种于罗氏培养基37℃培养2LLB培养液中，37℃振摇培养至对数生长期，IPTG诱导，集菌，先进行SDSPAGE，然后将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，剪下表达位置的条带.　　1.2.4免疫动物分组实验共分4组，每组10只小鼠.一组用Ag85BESAT6融合蛋白转膜条带免疫BALB/c小鼠；一组用ESAT6Ag85B融合蛋白免疫BALB/c小鼠.两

6、组免疫剂量均为10份条带/只，包埋于小鼠腹股沟处皮下，共免疫3次，每次间隔2in离心20min.吸取中间单核细胞层，用RPIM1640液洗涤两次后计数.　　1.2.6特异性淋巴细胞增殖实验将分离的淋巴细胞浓度调整至5×108/L，在96孔板中用100mL/LFCS的RPMI1640完全培养液培养，200μL/孔，同时实验组每孔加入25μLMTBCFP（25mg/L溶于PBS，本室制备），对照组不加CFP，调零孔不加脾细胞，37℃50mL/LCO2孵箱培养68h后，每孔加20μLMTT（5g/L，溶于PBS，pH7.2，过滤除菌），继续培养4h后弃上清，加DMSO150μL/孔

7、，振荡10min，测定A490nm值.结果用刺激指数SI=A（实验组）/A（对照组）表示.　　1.2.7IFNγ的诱生及含量的测定5×109/L脾细胞在24孔板用含10mL/LFCS的RPMI1640完全培养液中培养，800μL/孔，同时加入MTBCFP100μL/孔，37℃50mL/LCO2孵箱培养72h，收集培养液，5000r/min离心5min，取上清，-20℃冻存备检.参照试剂盒说明（夹心ELISA法）测定各标本所含IFNγ浓度.　　2.2抗原特异性脾脏淋巴细胞增殖实验分离免疫小鼠的脾脏淋巴细胞