结核分枝杆菌分泌蛋白ag85b的免疫学特性

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1、结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的免疫学特性摘要:目的研究原核表达的结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的免疫学特性.方法用原核表达的Ag85B蛋白免疫BALB/c小鼠，ELISA法检测免疫小鼠的体液免疫应答效果.分离免疫小鼠的脾淋巴细胞，体外用抗原再刺激，MTT方法检测IFN-γ产生水平和MTT法检测淋巴细胞增殖.结果Ag85B免疫小鼠可引起较高水平的特异性抗体应答，免疫小鼠的脾淋巴细胞体外用抗原再刺激，淋巴细胞的增殖较显著.MTT方法检测Ag85B免疫小鼠的IFN-γ量为960pg・L-1，而生理盐水对照组的量低于80pg・L-1.结论Ag85B有可

2、能作为新型结核疫苗的组分.　　Keyycobacterium;Ag85B;immunobiology　　Abstract:AIMToinvestigatetheimmunobiologicalproper-tiesofsecretoryproteinAg85BofMTBH37Ra.METHODSBALB/cmicemunizedmunized　micesera.LevelofIFN-γsecretedfromsplenocytesoftheimmunizedmiceafterspecific-antigenstimulationmunizedmiceinresponseto

3、antigenrestimulationethod.RESULTSAg85B-immunizedmiceinducedhigheranti-Ag85Bantibodytiter，andprotectivecellular-mediatedimmunityulationsecretedincreasedlevelsofIFN-γandproliferatedsignificant┐ly.CONCLUSIONAg85Bcanbeusedasanovelponentofthenea公司，IFN-γ标准品购自晶美公司（Pe-proTechEc产品，England），大肠杆菌重组表达

4、的Ag85B标准品及其特异性单抗由加州大学HarthG博士惠赠，BALB/c雄性小鼠20只6～8in-1离心5min，取上清（简称匀浆上清），于小鼠后大腿每侧各肌肉注射50μL，同时设BCG免疫组和生理盐水阴性对照组.　　1.2.3血清抗Ag85B抗体的测定免疫完成后第2周剪尾取血，分离血清，1∶20稀释后，ELISA方法测定血清中抗Ag85B抗体的滴度，每孔用Ag85B标准品（5mg・L-1）包被酶标板，4℃过夜，10g・L-1BSA37℃封闭30min，洗涤后加不同稀释度的待测血清，二抗为羊抗鼠IgG-HRPOPD产物显色后，测A490nm光

5、吸收值，以正常鼠血清作阴性对照，P/N≥2.1为阳性.　　1.2.4抗原特异的脾淋巴细胞增殖实验分别分离各组小鼠的脾淋巴细胞，调整细胞数为5×108・L-1，每孔200μL，在96孔板用含100mL・L-1FCS的RPM11640完全培养液中培养，同时每孔加入匀浆上清50μL为实验组，对照组不加匀浆上清，调零孔不加脾细胞，37℃50mL・L-1CO2孵箱培养68h后，每孔加入20μLMTT（5g・L-1，溶于PBS，pH7.2）继续培养4h后终止培养，去尽上清，每孔加入DMSO150μL，振荡10min，测A490nm

6、值，结果用刺激指数（stimulationindex，SI）=实验组A值/对照组A值.　　1.2.5IFN-γ的诱生和测定［4］5×109・L-1脾细胞在96孔板用含100mL・L-1FCS的RPMI1640完全培养液培养，每孔200μL，同时每孔加入匀浆上清50μL，37℃50mL・L-1CO2孵箱培养72h后，每组3个孔中的培养液混合，5000r・min-1离心5min，取上清于-20℃冻存备检.MTT法检测IFN-γ含量.L929细胞用含50mL・L-1FCS的RPMI1640完全培养液在96孔板培

7、养，每孔约3×104个细胞，各加不同稀释度的待检样品和IFN-γ标准品，37℃50mL・L-1CO2孵箱培养24h，再加50μL100TCID50VSV攻击20h，每孔加入20μLMTT，继续培养4h后终止培养，同上检测A490nm值，以标准IFN-γ为准根据直线作图法计算待测IFN-γ含量（1U相当于100pg）.统计学处理:数据采用x±s表示.采用t检验进行组间处理，P<0.05为差异有显著性.　　2结果　　2.1原核细胞表达结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B及其产物的鉴定表达菌经诱导后，进行1