结核分枝杆菌分泌蛋白ag85b的免疫学特性论文

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1、结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的免疫学特性论文.freelycobacterium;Ag85B;immunobiologyAbstract:AIMToinvestigatetheimmunobiologicalproper-tiesofsecretoryproteinAg85BofMTBH37Ra.METHODSBALB/cmicemunizedmunizedmicesera.LevelofIFN-γsecretedfromsplenocytesoftheimmunizedmiceafterspecific-antigenstimulationmunizedmiceinresponsetoa

2、ntigenrestimulationethod.RESULTSAg85B-immunizedmiceinducedhigheranti-Ag85Bantibodytiter，andprotectivecellular-mediatedimmunityulationsecretedincreasedlevelsofIFN-γandproliferatedsignificant┐ly.CONCLUSIONAg85Bcanbeusedasanovelponentofthenea公司，IFN-γ标准品购自晶美公司（Pe-proTechEc产品，England），大肠杆菌重组表达的Ag85B标准品及

3、其特异性单抗由加州大学HarthG博士惠赠，BALB/c雄性小鼠20只6～8in-1离心5min，取上清（简称匀浆上清），于小鼠后大腿每侧各肌肉注射50μL，同时设BCG免疫组和生理盐水阴性对照组.1.2.3血清抗Ag85B抗体的测定免疫完成后第2周剪尾取血，分离血清，1∶20稀释后，ELISA方法测定血清中抗Ag85B抗体的滴度，每孔用Ag85B标准品（5mgL-1）包被酶标板，4℃过夜，10gL-1BSA37℃封闭30min，洗涤后加不同稀释度的待测血清，二抗为羊抗鼠IgG-HRPOPD产物显色后，测A490nm光吸收值，以正常鼠血清作阴性对照，P/N≥2.1为阳性.1.2.4抗原特异的

4、脾淋巴细胞增殖实验分别分离各组小鼠的脾淋巴细胞，调整细胞数为5×108L-1，每孔200μL，在96孔板用含100mLL-1FCS的RPM11640完全培养液中培养，同时每孔加入匀浆上清50μL为实验组，对照组不加匀浆上清，调零孔不加脾细胞，37℃50mLL-1CO2孵箱培养68h后，每孔加入20μLMTT（5gL-1，溶于PBS，pH7.2）继续培养4h后终止培养，去尽上清，每孔加入DMSO150μL，振荡10min，测A490nm值，结果用刺激指数（stimulationindex，SI）=实验组A值/对照组A值.1.2.5IFN-γ的诱生和测定［4］5×109L-1脾细胞在96孔板用含

5、100mLL-1FCS的RPMI1640完全培养液培养，每孔200μL，同时每孔加入匀浆上清50μL，37℃50mLL-1CO2孵箱培养72h后，每组3个孔中的培养液混合，5000rmin-1离心5min，取上清于-20℃冻存备检.MTT法检测IFN-γ含量.L929细胞用含50mLL-1FCS的RPMI1640完全培养液在96孔板培养，每孔约3×104个细胞，各加不同稀释度的待检样品和IFN-γ标准品，37℃50mLL-1CO2孵箱培养24h，再加50μL100TCID50VSV攻击20h，每孔加入20μLMTT，继续培养4h后终止培养，同上检测A490nm值，以标准IFN-γ为准根据直线

6、作图法计算待测IFN-γ含量（1U相当于100pg）.统计学处理:数据采用x±s表示.采用t检验进行组间处理，P0.05为差异有显著性.2结果2.1原核细胞表达结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B及其产物的鉴定表达菌经诱导后，进行120gL-1SDS-PAGE，发现约在Mr为31000处有一条蛋白带，同预计的大小相吻合（Fig1）.将其与抗Ag85B特异性mAb做免疫印迹，发现在Mr约为31000处表达有一条带，表明此表达产物含有能与抗Ag85B的特异性mAb相结合的表位.图1略2.2血清抗Ag85B抗体的水平用ELISA的方法对免疫后的各组小鼠血清中Ag85B抗体的水平进行了测定，生理盐水对照组

7、的鼠血清Ag85B抗体为阴性.Ag85B免疫和BCG免疫组鼠血清Ag85B抗体滴度分别为1∶160和1∶80.2.3脾淋巴细胞增殖实验Ag85B免疫小鼠及BCG免疫小鼠的淋巴细胞在体外用匀浆上清刺激，可引起淋巴细胞显著的增殖反应.而生理盐水对照组的小鼠脾淋巴细胞的增殖不显著（Fig2）.图2略2.4IFN┐γ的水平Ag85B免疫小鼠及BCG免疫小鼠的脾淋巴细胞用匀浆上清刺激，悬液中IFN-γ的水平用MTT方法