t-bet基因佐剂对ag85b抗结核dna疫苗的免疫调节

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1、中图分类号：墅里2=3学科分类号：三!Q生2论文编号：密级：公珏安徽理工大学硕士学位论文T．bet基因佐剂对A985B抗结核DNA疫苗的免疫调节作者姓名：医匦莲专业名称：疸厦生物堂研究方向：佥王鱼瘗堂撞苤导师姓名：蜚苤这塾援导师单位：塞邀堡王太堂答辩委员会主席：奎塑昌熬援论文答辩日期：2013年5月31日安徽理工大学研究生处2013年6月8日ADissertationinPathogenBiology．Immuno——regulationofT-betadjuvantonA985BDNAvacc

2、lnationagainsttuberculosisll-●。‘Candidate：ChenLipingSul3ZhangRongbobuDervlsor：LnangKongboMedicalSchoolAnHuiUniversityofScienceandTechnologyNo．168，ShungengRoad，Huainan，232001，P．R．CHINA独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方以外，论

3、文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塞邀理王太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：蝉日期：必j月《日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解塞徵理王太堂有保留、使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属于皇徵理王太堂。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权安徽理工大学可以将学位论文的全部或部

4、分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者张砾砀砗签字日期．郴年乡月斯导师鲐乙梦lk签字吼矽f多年乡月扩日摘要目的分别构建T-bet和A985B真核表达质粒，将T-bet质粒作为基因佐剂与A985B质粒分子配伍构建新型DNA疫苗，并通过体内外实验观察其免疫调控作用，为结核等Thl失衡性疾病的防治提供新的理论与实验依据。方法1．根据GenBank报道的目的基因(A985B和T-bet基因)全长序列和pcDN

5、A3．1(一)、pET-28a(+)质粒酶切位点的特点，用DNAClub和PremierPrimer5软件设计特异性引物。PCR扩增出A985B和T-bet基因，分别利用限制性内切酶BamHI、HindlII和XhoI、EcoRI对相应PCR产物和空质粒pcDNA3．1(．)同时进行双酶切，纯化酶切产物，利用连接酶连接，经菌液PCR、酶切及测序鉴定重组质粒pcDNA3．1(一)一A985B和pcDNA3．1(一)一T-bet。2．将上述成功获得的重组质粒pcDNA3．1(-)-A985B经双酶切

6、后，将酶切获得的A985B基因亚克隆至原核表达质粒pET-28a(+)，回收目的基因与载体片段后酶连，转化DH5a筛选重组质粒，酶切鉴定原核表达质粒pET-28a(+)一A985B。3．将上述重组成功的质粒pET-28a(+)-A985B转化至大肠杆菌BL21(DE3)，用诱导剂IPTG诱导表达重组蛋白rA985B，经SDS．PAGE分析rA985B表达情况并通过His柱亲和层析进行纯化，利用His单抗进行Westernblot鉴定。4．采用脂质体法转染重组质粒至RAW264．7细胞，于37"C

7、，5％C02温箱中培养24"～48h后，Westemblot法检测质粒蛋白表达情况。5．3次肌肉注射免疫BALB／c小鼠，末次免疫2周后，ELISA法检测血清中抗A985B抗体滴度。同时将小鼠脾脏淋巴细胞于A985B刺激下培养，ELISA法检测培养液中细胞因子(IFN—Y／IL．2／IL一4／IL．10)分泌情况。结果1．利用特异性引物，以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA和健康小鼠脾脏淋巴细胞总RNA为模板扩增出目的基因片段，经DNA凝胶电泳鉴定DNA条带分别出现在1091bp和1608

8、bp左右。2．真核表达重组质粒pcDNA3．1(·)一A985B、pcDNA3．1(一)一T-bet和原核表达质粒pET-28a(+)一A985B经菌液PCR、双酶切鉴定及测序验证后证实构建成功。摘要3．转化了pET-28a(+)一A985B重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)在IPTG诱导下表达重组蛋白rA985B，经SDS—PAGE证实表达的rA985B与预测的分子量大小相符，经亲和层析后获得纯化重组蛋白rA985B。4．将不同浓度的真核表达质粒pcDNA3．1(一)-A985B、pcDNA