霍乱肠毒素基因分子佐剂DNA疫苗构建的实验研究

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1、四川大学硕士学位论文霍乱肠毒素基因分子佐剂DNA疫苗构建的实验研究硕士研究生：张莉导师：陈建平教授中文摘要霍乱是世界七大流行病之一，为我国甲类法定传染病，它是由霍乱弧菌引起的一种烈性肠道传染病，具有发病急、传播快、波及面广的特点，危害极其严重。自1817年以来，已发生过7次世界大流行。霍乱肠毒素(Choleraenterotoxin,CT)是引起霍乱的主要致病因子，由—个A亚单位(CTA)和5个相同的B亚单位(CTB)组成。它是一种很强的免疫原和粘膜免疫佐剂，可用于研制粘膜疫苗。由于CT佐剂活性的作用机制一直没被真正阐明，在某种程度上妨碍了对它的应用。目前，

2、对CT亚单位蛋白CTB及其编码基因ctxB作为粘膜佐剂的研究较多，对其亚单位蛋白CTA和CT全毒素作为佐剂的研究较少，将ctxA基因、砌基因和cccA、c执B的融合基因c抚AB作为佐剂分子，同时比较三者在动物体内的佐剂活性研究还尚未见报道。本研究选择霍乱弧茵肠毒素(ctx)基因为研究对象，首次利用重叠PCR将ctrA基因和ctxB基因融合为ctxAB融合基因，同时构建了ctrA、ctrB和ctrAB三种分子佐剂DAN疫苗，为探讨ctxAB融合基因与曲【A基因、ctxB基因的佐剂活性及其作为佐剂分子的应用价值奠定了基础。首先，从G-enBank上获取霍乱弧菌5

3、69B的肠毒素基因序列，利用四J11大学硕士学位论文软件Primer5．0设计最佳引物，以霍乱弧菌569B株基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得霍乱弧菌ctxA基因和cocB基因，将ctxA基因和ctxB基因分别定向克隆入原核表达载体pET32a(+)，构建原核表达重组质粒pET-ctxA和pET-ctxB，并诱导它们在大肠杆菌中分别表达出49kDa、31kDa融合蛋白。其次，以纯化后的PCR反应产物ctxA和ctxB基因为模板，利用重叠PcR技术，通过两轮PCR扩增出融合的axAB基因。将ctxAB基因定向克隆入原核表达载体pET32a(+)，构建原核表

4、达重组质粒pET-ctxAB，并诱导其在大肠杆菌中分别表达出60kDa的融合蛋白。最后，将霍乱弧菌ctxA基因、ctxB基因和ctxAB融合基因插入真核表达载体pcDNA3．1(+)，构建真核表达重组质粒pcDNA3．1-ctxA、pcDNA3．1．-ctxB和pcDNA3．1-ctxAB，体外转染NIH3T3细胞后，用免疫荧光法检测出三种基因在NIH3T3细胞中的瞬时表达，利用Westernblot印迹检测到转染的阳性细胞克隆稳定表达出约29kDa、llkDa和40kDa的蛋白。实验结果表明：成功构建了ctxA、ctxB和ctxAB融合基因的原核表达重组质

5、粒并在大肠杆菌中表达出相应分子量大小的蛋白，同时ctxA、ctxB和ctxAB融合基因的真核表达重组质粒在体外哺乳动物细胞转染试验中也检测到了相应蛋白的有效表达，表明霍乱肠毒素基因具有在动物和人体内作为分子佐剂DNA疫苗的潜在应用价值。本研究首次利用重叠PCR技术将ctxA和ctxB基因融合为ctxAB融合基因，所构建的三种霍乱肠毒素基因分子佐剂DNA疫苗为今后进行体内动物实验研究其佐剂效果提供了研究基础。关键词：霍乱肠毒素分子佐剂DNA疫苗ctxA基因ctxB基因ctxAB融合基因2四川大学硕士学位论文ExperimentalStudyontheConst

6、ructionofMolecularAdjuvantDNAVaccineofCholeraEnterotoxingenePostgraduate：ZHANGLiTutor：ProLCHENJian-pingAblstractCholeraisanacutediarrhealdiseasewithcharacterisdcsofsp∞adingquicklyandSeVeredamage．Itisthefirstclassofquaran血eddiseasesinChinaand013eofworldsevenpandemicdi∞ascs．Therehadb

7、eenseVenextensiveepidemicsintheworld8iIIC冶1817．Choleraenterotoxin(∞composedof013eAsubunit(CTA)andfiveBsubunits(CTB)isallmajorcausativeagentofvibriocholerae．AsabetterimmunogenandmtloDsaimmanoadjuvantitcarbeusetodevelopmuP∞saVaccine．Atpresentresearchofmucosavaccine011CTBsubunitprotei

8、onand砌geneofcholeratoxinis