HIV1 Tat 蛋白结合Tar的抗艾滋病药物筛选模型的建立研究.doc

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1、HIV1Tat蛋白结合Tar的抗艾滋病药物筛选模型的建立研究作者：李在留刘朝奇，邹坤，李凤兰，韩钰，杨凡，王磊黎【摘要】　　目的建立HIV-1Tat蛋白结合Tar的抗HIV-1药物筛选模型用于抗HIV药物筛选。方法构建表达HIV-1Tat蛋白的真核表达质粒（pCDNA3.1(+)-Tat）和HIV-1LTR-luc荧光素酶报告基因，采用脂质体转染法共转染HeLa细胞，荧光仪检测Tat蛋白促进荧光素酶在HeLa细胞内的表达情况，建立HIV-1Tat蛋白结合Tar的细胞模型，用于抗HIV-1的药物筛选。以DRB（5,6-二氯-1-β-呋核亚硝脲-苯并咪唑）为阳性对

2、照，进行模型的建立及条件的优化。结果通过反复试验表明，目的基因和报告基因的配比、转染时培养液中小牛血清的含量、细胞浓度、转染前细胞状态以及药物作用时间的长短等对模型的稳定性和敏感性有影响。结论应用优化的细胞模型对文冠果、紫苏等浸提物进行筛选及结果的分析。【关键词】HIV-1TatLTR-Luc荧光素酶基因艾滋药物筛选模型　　Abstract:ObjectiveToestablishHIV-1TalbindingtoTarmodel.MethodsHIV-1Tatproteineukaryoticexpressionplasmid（pCDNA3.1(+)-Tat）

3、andluciferasereportgeneHIV-1LTR-luc(LTR-LUC)wereconstructedandtransfectedintoHeLacellswithlipofectamine2000.TheexpressionofHIV-1TatproteininHeLacellswasdetectedwithIuminometer.HIV-1TatproteinbindingtarmodelforscreeningHIV-1inhibitorswastherebyconstructed.ResultsTheabstractionsofXanth

4、ocerassorbifoliaandPerillafrutescensandsoonweredetectedandDRB(5,6-dichloro-1-β-D-robofuranosylbenzimidazole)waspositivecontrol.Thestabilityofthemodelwastestedandregulated.ConclusionTherepeatedexperimentsindicatethatthematchingofpurposegeneandreportgene,therateofnewcalfseruminmediumdu

5、ringtransfection,densityofthetransfectedcells,conditionoftheuntransfectedcellsandtheactiontimeofdrugsaffectthestabilityandsensitivityofthemodel.　　Keywords:HIV-1Tat;LTR-Lucluciferasegene;Modelforscreening　　人类免疫缺陷病毒（HIV）是获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的病原体；是一种逆转录RNA病毒，被称为“20世纪的瘟疫”，在全球广为传播，至今尚无根治药物。现已

6、批准上市的药物（HIV蛋白酶、逆转录酶抑制剂）只能缓解病痛，价格昂贵、毒副作用大，病毒易产生变异性、耐药性，药效较差、抵消等［1，2］。因此，从艾滋病病毒的基础研究中寻找新的不易产生耐药性的靶点成为国内外研究热点。目前抗HIV6药物的研究重点集中在逆转录酶、蛋白酶、整合酶及病毒吸附、融合等几个靶点。HIV反式激活因子(transactivator，Tat)作为HIV的调节蛋白，不仅可以通过反式激活效应调控病毒基因的复制与表达，还可以诱导细胞凋亡，激活静态T淋巴细胞，抑制免疫细胞的分化和增殖，有助于病毒的感染和体内传播，导致各种并发症等［3，4］。Tat与反式激活

7、效应区（trans-activatorresponseregion，TAR）RNA相互作用，反式激活转录。Tat和TAR的结构具有高度保守性，使它成为寻找新的作用机制和不易产生耐药性的抗艾滋病药物的非常有吸引力的新靶点［5］。　　Tat基因编码蛋白可与HIV-1病毒长末端重复序列（LTR）结合，以增加病毒所有基因转录率，也能在转录后促进病毒mRNA的翻译，导致病毒的复制增加［6］。本研究通过建立HIV-1Tat和LTR的结合，导致报告基因荧光素酶在细胞内的高表达，反映Tat和LTR序列的有效结合，建立Tat的反式激活效应调控病毒基因的复制与表达模型，从而用于天然

8、药物有效成分的筛选，具有