apicidin对hiv-1潜伏体外激活的研究及用于药物筛选hiv-1体内、外模型建立

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1、万方数据。，嚏面目录』Y删删2删7㈣02舢4删舢4删9删中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯二：二⋯⋯j．：二i⋯⋯⋯⋯⋯．．1万方数据复旦大学硕士学位论文中文摘要3．5．小鼠中DNA及表型水平上的GFP检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．483．6．反向PCR检测HIV在小鼠基因组中的整合位点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一503．7．转基因小鼠整合位点旁侧序列Blast定位⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．504．讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯s3参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．s5附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．59综述：HIV．1潜伏感染模型研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．59研究生期间工作成绩⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．70致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．712万方数据复旦大学硕士学位论文摘要中文摘要高效抗逆转录病毒疗法(HAART)的出现大大降低了艾滋病的发病率和死亡率，它能够将艾滋病病人外周血中的病毒拷贝数降低至临床检测水平以下(<50拷贝病毒RNA／毫升)。但在病人体内长期

3、存在一类细胞，它们的基因组中整合有HIV但不表达；而当细胞被活化或者受到外界刺激时，这些潜伏的HIV就可能被活化从而产生新的病毒。因此我们称这些细胞为潜伏感染细胞。这类细胞与正常细胞在免疫学上无法区分，从而能够逃避免疫系统的清除作用。一旦停止抗逆转录病毒治疗，由于潜伏病毒的激活和扩增，外周血中病毒拷贝数会迅速反弹至治疗前。潜伏感染细胞的存在，是造成目前HAART疗法不能治愈艾滋病的主要原因。在辅以抗逆转录病毒疗法的同时激活潜伏感染细胞中的病毒，就可以借助免疫系统的作用杀死这些潜伏感染细胞，从而减小甚至清除体内的病毒潜伏库，这就是“激活一清除”策略的主要思路。

4、一些用以激活潜伏病毒的激活剂的开发工作也正在进行中，这其中包括有组蛋白去乙酰化酶抑制剂，淋巴因子，MicroRNA等。这些关于HIV潜伏感染方面的研究工作提示了我们，一方面，“激活一清除”策略需要我们对细胞中HIV潜伏感染潜伏和再激活的分子机制有更加深入的认识；另一方面，建立更为有效的用以药物筛选的模型，也是成功筛选高效、低毒性HIV潜伏激活剂的一个关键。因此，针对上述问题，我们进行了以下研究：在第一部分中，我们选择了组蛋白去乙酰化酶抑制剂Apicidin作为研究对象。由于组蛋白乙酰化在H工v-l潜伏方面的重要作用，组蛋白去乙酰化酶抑制剂是一类具有很高临床前

5、景的激活药物。Apicidin是一类用于抗寄生虫的真菌分泌物，在之前的研究中被发现能够激活潜伏的HIV一1，但是对它的激活作用并没有进行深入的研究。我们利用HIV一1潜伏感染细胞AIO．6模型，通过GFP阳性细胞数来研究Apicidin对于HIV-I的激活效率。实验结果发现Apicidin对潜伏的HIV—l的激活具有浓度依赖性，在lpM浓度时可以达到最高的24．9％的激活效果。同时，药物动力学实验表明Apicidin激活AIO．6细胞具有时间依赖效应，24h即可到达最佳激活效果。我们进一步在Jurkat细胞中评估了Apicidin的毒性，结果显示Apicid

6、in在Jurkat细胞中的CC50为630nM。联合使用Apicidin和1万方数据复旦大学硕士学位论文中文摘要另一类组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA，显示出Apicidin和TSA对于HIV一1的激活有协同作用。最后，我们进行了染色质免疫共沉淀实验来探讨Apicidin激活潜伏HIV一1的机制。我们发现在Apicidin处理后，HIV一1LTR上Nuc一1区域组蛋白H3和H4乙酰化水平都得到了提高，分别为未处理组的l-34和3．15倍。因此，我们可以得出结论：Apicidin能够有效地激活潜伏感染细胞中HIV一1的表达，并且这一激活作用是通过提高HIV-ILT

7、RNuc一1区域组蛋白乙酰化水平来产生的。在第二部分的研究中，我们拟建立一个用于HIV=I药物筛选的体外细胞模型。由于NF-KB和Tat这两种转录调控因子在HIV—l潜伏建立及激活方面的重要性，我们构建了HIV一1LTR上KB和TAR顺式元件突变的荧光素酶稳定表达载体，并再通过质粒转染293细胞及G418筛选，获得了相应的细胞克隆。从每个克隆中抽提基因组DNA，PCR以及测序结果表明了细胞模型中LTR相应位置序列得到了正确的突变。我们进一步通过一种经典的激活剂TNF-Q去处理这些细胞模型，结果显示lOng／mLTNF—Q可以有效地激活野生型LTR和△TARL

8、TR细胞(分别为2。87倍和1．5l倍)，然而对于A