体外胰岛素抵抗细胞模型的建立和在药物筛选中的应用

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1、万方数据万方数据·972·中国药理学通报c^i础e肌口删f昭话of日Ⅱf如砌2008Jul；24(7)基，于37℃、5％c0：培养箱中孵育36h后，弃去培养基，先用0．0lm01．L“PBS洗涤1次，再用pH6．0的培养基37℃孵育20min。重复上述过程1次，最后用O．01肿1．L。PBS洗涤后，换

2、：无血清的培养基。孵育24h后，用葡萄糖临床试剂盒检测培养基上清液中的葡萄糖含量。计算空白组与不同胰岛素浓度组细胞的葡萄糖消耗量差值，选择匍萄糖消耗量差值最大，即达到胰岛素抵抗最高状态的胰岛素作用浓度为胰岛素最佳浓度。确定胰岛素最佳浓度后，重复上述方法，将细胞分为空白

3、组及模型组，空白组加入正常培养基。模型组加入新鲜配制的含有胰岛索最佳浓度的培养基，计算空门组与胰岛素作用时间分别为24、36、48和60h模型组细胞的葡萄糖消耗馈差值，同样选择葡萄糖消耗量差值最大，即达到胰岛素抵抗最高状态的胰岛素作用时间为胰岛素作用的最佳时间。采用上述方法选择最佳胰岛素浓度和胰岛素作用时间。由此建立适宜的高浓度胰岛素诱发的Hepc2胰岛素抵抗细胞模型。2．1．3HepG2胰岛素抵抗细胞模型持续时间的研究采用2．1．2建寺的最佳造模方法造模成功后。将空白组与模型组细胞同时置于不含胰岛素的正常培养基中继续培养24、48、72h后，用葡萄糖临床试剂盒榆测

4、培养基上清液中的葡萄糖含量。计算空白组及模型组细胞的葡萄糖消耗量。2．I．4HepG2细胞形态学的变化在最佳胰岛素抵抗造模条件即10“moI．L。1胰岛素作用36h后通过HE染色观察细胞形态。取有培养细胞生长的玻片。37℃PBS漂洗培养基及杂质，4％多聚甲醛固定15min后取出晾干，常规HE染色。倒置相差显微镜观察细胞的大体形态。8J。2．2313-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型的建立2．2．131r3．Ll脂肪细胞的体外培养参考AnilKumar_9j分化前脂肪细胞的方法，对细胞进行分化：将3，13．Ll前脂肪细胞置于含lO％小牛血清的DMEM高糖培养基中，37℃、5

5、％C0，、饱和湿度下培养。待细胞融合2d后，加含0．5mmoI．L。13一异丁基．1．甲基黄嘌呤，0．25斗m01．L“地塞米松，10mg·L‘1胰岛素。lO％小牛血清的DMEM高糖培养基培养48h，换以含lOmg·L叫胰岛素的培养基再培养48h，随后以10％小牛血清的DMEM高糖培养基继续培养，2d换培养液1次，诱导分化8—12d的3％一L1细胞90％以上呈脂肪细胞表型可用于试验。2．2．231r3-L1胰岛素抵抗细胞模型的建立¨0’⋯将上述分化成熟的3乃-L1脂肪细胞转入96孔细胞培养板中继续培养，分为空白组及模型组，空白组加入正常培养基，模型组加入含终浓度为l

6、“m01．L“地塞米松的培养基，每24h用葡萄糖临床检测试剂盒测定培养基上清液中的葡萄糖含量，计算空白组及模型组细胞的葡萄糖消耗镀，得出空白组及模型组每24h的葡萄糖消耗鼋差值，选择葡萄糖消耗差值最大，即达到胰岛素抵抗最高状态的时间为最佳造模时间。由此确定最佳造模方法。2．2．33T3．Ll胰岛素抵抗细胞模型稳定性的研究采用2．2．2建立的最佳造模方法造模成功后，将空白组与模型组细胞同时置于不含地塞米松的正常培养基中继续培养，每隔24h用葡萄糖临床检测试剂盒测定培养基上清液中的葡萄糖含量，计算空白组与模型组细胞的葡萄糖消耗量，得出宅白组及模犁组每24h的葡萄糖消耗量

7、差值。2．3HepG2胰岛素抵抗细胞模型在筛选药物中的应用在HepG2细胞胰岛素抵抗模型建立后，进行地黄寡糖、小檗碱、人参皂苷、水苏糖、罗格列酮对HepG2胰岛素抵抗细胞模型的作用比较，药物的终浓度均为lOmg·L一。上述各组均包括加胰岛素(10nm01．L“)处理组和不加胰岛素处理组。加药物12、24、36和48h后检测培养基上清液中的葡萄糖含量，计算模型组与给药组细胞的葡萄糖消耗量。2．4313·Ll脂肪细胞胰岛素抵抗细胞模型在药物筛选中的应用在脂肪细胞胰岛素抵抗模型建立后，进行地黄寡糖、小檗碱、人参皂苷和罗格列酮对313．I。I脂肪细胞胰岛素抵抗细胞模型的作用

8、比较，药物的终浓度均为10mg·L～。加约物24、48、72和96h后用葡萄糖检测试剂盒测定细胞培养基上清液中的葡萄糖含量。计算模型组与给药组细胞的葡萄糖消耗量。2．5统计学处理测定的数据经sPsS11．O统计软件系统进行统计学分析，以茗±s表示，组间差异的显著性采用￡检验。3结果3．1不同胰岛素浓度和胰岛素作用时间对HepG2细胞胰岛素抵抗的影响如眺1所示，与空白组相比，胰岛素浓度由10～mo卜L“增加到10“moI·L。时，模型组细胞对葡萄糖的消耗逐渐减少。10。6m01．L“时达到最小(P