地塞米松诱导3t3l1脂肪细胞胰岛素抵抗模型的建立

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1、地塞米松诱导3T3L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型的建立【摘要】目的应用地塞米松诱导3T3L1脂肪细胞，探讨建立方便可靠的胰岛素抵抗（IR）细胞模型的方法。方法3T3L1前脂肪细胞经1甲基3异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素诱导分化成3T3L1脂肪细胞,将其与10nmol/L和100nmol/L、1μmol/L地塞米松共孵育，100nmol/L胰岛素作用30min刺激脂肪细胞糖转运。以葡萄糖氧化酶法测定培养液中残余的葡萄糖含量，观察地塞米松对脂肪细胞糖摄取的影响，鉴定IR模型。结果地塞米松抑制胰岛素诱导前后的脂肪细胞糖转运，抑制作用呈剂量依赖性，其中1μmol/L地

2、塞米松的抑制率分别为80%及75%(P<0.05)。结论地塞米松可诱导3T3L1脂肪细胞产生IR，这种细胞模型简便、可靠。【关键词】地塞米松胰岛素抗药性胰岛素3T3L1细胞胰岛素抵抗（IR）是2型糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化等疾病的共同发病基础，研究IR发生机制成为当今的重要课题。糖皮质激素是重要的胰岛素拮抗激素，临床上的过量应用会导致糖耐量异常甚至糖尿病的发生，动物试验中常用于建立糖尿病模型[12]。笔者以3T3L1脂肪细胞为研究对象，将糖皮质激素的长效类似物地塞米松与3T3L1脂肪细胞共孵育，观察处理前后3T39L1脂肪细胞对胰岛素短时诱导的葡萄糖摄取

3、量的变化，探讨利用地塞米松建立3T3L1脂肪细胞IR模型的可行性。1材料与方法1.1材料1.1.1细胞3T3L1前脂肪细胞株由上海内分泌代谢病临床医学中心惠赠。1.1.2试剂DMEM培养基、胰蛋白酶（美国Gibco公司）。胎牛血清（美国PAA公司）。胰岛素（丹麦诺和诺德公司）。地塞米松（D4902）、1甲基3异丁基黄嘌呤（1methyl3isobuthylxanthine,I5879,美国Sigma公司)。葡萄糖检测试剂盒（瑞士Roche公司)。1.1.3仪器二氧化碳培养箱（MCO15AC，日本Sanyo公司）。生化检测仪（CX7，美国Beckman公

4、司）。1.2方法1.2.13T3L1前脂肪细胞的培养和诱导分化3T39L1前脂肪细胞以含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素的DMEM培养液，在37℃、体积分数为0.07的CO2的条件下培养，隔天换液1次。细胞融合达80%～90%时，以0.25%胰蛋白酶消化、传代接种至24孔培养板上。细胞融合后，加含0.5mmol/L1甲基3异丁基黄嘌呤、1μmol/L地塞米松和10μg/mL胰岛素的DMEM培养液培养48h[3]；再以含10μg/mL胰岛素的DMEM培养液培养48h，随后以DMEM培养液继续培养6d，诱导分化10d左右的3T3L1细

5、胞90%呈脂肪细胞表型，细胞内可见明显脂滴。1.2.2油红O染色法鉴定脂肪细胞以10%多聚甲醛固定细胞10min,PBS洗去后晾干。加油红O染液10min后弃去，以异丙醇洗细胞2次，用苏木精染细胞核2min。水洗5～10min，倒置显微镜下观察结果，拍摄照片。1.2.3分组将3T3L1脂肪细胞分为基础（非诱导）组和胰岛素诱导组（诱导组），每组再分为对照组、10nmol/L，100nmol/L和1μmol/L地塞米松组。细胞同步化12h，每孔加入含地塞米松的培养液，终浓度分别为10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L；对照组加入等体积培养液。温育48h后诱导组

6、中4个实验组均加入100nmol/L胰岛素继续温育30min。1.2.4测定3T39L1脂肪细胞糖转运取细胞上清液。用葡萄糖氧化酶法测定上清液的葡萄糖含量，以未接种细胞空白复孔的糖含量均值相减，得出各孔细胞的葡萄糖消耗量。1.3统计学处理数据以x±s表示,用SPSS11.0软件进行统计学处理。各组间的比较采用单因素方差分析，对照组与不同浓度地塞米松组之间的比较采用Duncan法。将药物浓度值进行对数转换，采用直线回归分析药物浓度和抑制作用的关系。2结果A：3T3L1前脂肪细胞；B：3T3L1脂肪细胞；C：鉴定3T3L1脂肪细胞（油红O染色）.图13T3L1前脂肪

7、细胞的诱导分化及鉴定（×200）Fig1Identificationof3T3L1adipocyteswithoilredstaining2.13T3L1前脂肪细胞的诱导分化及鉴定经1甲基3异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素诱导分化10d后，细胞变圆、变亮，细胞质中大量圆形脂肪滴聚集，称为3T3L1脂肪细胞。以油红O染色鉴定3T3L1脂肪细胞，可见细胞质内脂肪滴被染成红色，细胞核呈蓝色（图1）。2.2地塞米松对3T3L1脂肪细胞糖转运的影响2.2.1非诱导组100nmol/L、1μmol/L地塞米松处理48h后，